21世紀(jì),感染性疾病仍然是全球公共衛(wèi)生重大威脅,瘧疾、HIV等傳染病導(dǎo)至發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和死亡率不斷上升。同時(shí),由于國(guó)際貿(mào)易往來(lái)、全球旅行的增加,碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌、耳念珠菌等重要耐藥菌在全世界范圍出現(xiàn),迫切需要開(kāi)發(fā)敏感、快速、特異、穩(wěn)定、低成本和便于使用的診斷方法,促進(jìn)早期合理治療,阻止疾病傳播。
POCT由中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會(huì)POCT裝備技術(shù)專業(yè)委員會(huì)定義為:在采樣現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測(cè)結(jié)果的一種檢測(cè)方式??焖俚默F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)避免了多次就診或轉(zhuǎn)診,減少對(duì)經(jīng)驗(yàn)治療的依賴,從而促進(jìn)抗菌藥物合理使用。POCT檢測(cè)的靶標(biāo)通常是微生物抗原和抗原特異的患者血清抗體,以及病原體核酸或代謝物。本文介紹感染性疾病現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)技術(shù)的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀,以及推動(dòng)該領(lǐng)域前進(jìn)的未來(lái)方向。
病原體抗原直接檢測(cè)
大多數(shù)POCT快速診斷使用側(cè)流免疫層析(lateral flow immunology assay, LFIA)技術(shù)。例如目前應(yīng)用廣泛的A群鏈球菌抗原檢測(cè)、甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)、肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)、軍團(tuán)菌、肺炎衣原體抗原檢測(cè)等。LFIAs用于抗原檢測(cè)的性能關(guān)鍵取決于臨床樣品中分析物的濃度。分析物濃度低于檢測(cè)的檢測(cè)限可能會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。最近研究表明快速流感診斷試驗(yàn)與逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)或病毒培養(yǎng)相比靈敏度有限,并指出POCT試驗(yàn)陰性結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解讀,特別是當(dāng)流感流行季節(jié)。兒科常規(guī)應(yīng)用的A群鏈球菌快速診斷試劑的靈敏度約為86%,也存在一定的漏診。目前臨床診斷價(jià)值得到廣泛認(rèn)可的是隱球菌抗原試驗(yàn)。檢測(cè)血清、腦脊液和手指全血標(biāo)本的隱球菌莢膜多糖抗原側(cè)流免疫層析技術(shù)(cryptococcal antigen lateral flow assay ,CrAg LFA)的臨床診斷、療效評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)能力得到肯定。WHO建議在隱球菌感染高發(fā)地區(qū),CD4計(jì)數(shù)低于100個(gè)細(xì)胞/mm3的HIV患者在抗病毒治療開(kāi)始前應(yīng)考慮進(jìn)行血清或血漿CrAg篩查,并對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)者啟動(dòng)抗真菌搶先治療。近期CFDA將批準(zhǔn)國(guó)產(chǎn)CrAg LFA試劑用于臨床。
病原體特異性抗體檢測(cè)
POCT抗體快速檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用較為廣泛,其存在的問(wèn)題主要是抗體陽(yáng)性不能代表現(xiàn)癥感染,尤其多種抗體同時(shí)陽(yáng)性時(shí)給臨床診斷造成困惑,同時(shí)也存在靈敏度低導(dǎo)至假陰性的情況??贵w檢測(cè)更適合于流行病學(xué)調(diào)查或社區(qū)家庭初步篩查。HCV、梅毒、瘧疾、登革熱等抗體快速檢測(cè)在傳染病篩查中廣泛應(yīng)用。在社區(qū)呼吸道感染診治中,肺炎支原體抗體、呼吸道病原IgM五聯(lián)檢等結(jié)合炎癥標(biāo)志物CRP、降鈣素原(procalcitonin, PCT)、血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein, SAA)、IL-6等綜合分析,有利于制定早期治療方案??贵w檢測(cè)除應(yīng)用于血清或血漿外,OraQuick Advance快速HIV-1/2抗體檢測(cè)在2012年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為口腔液標(biāo)本使用的非處方測(cè)試。由于樣本采集的非侵入性,口腔液對(duì)患者可能更容易接受,也為出于隱私考慮不愿去醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)者提供選擇,并降低醫(yī)護(hù)人員的職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)。需要注意的是抗體檢測(cè)可能無(wú)法確定急性早期感染,存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。因此,發(fā)展更為靈敏、特異的及時(shí)診斷技術(shù)仍然是感染病診治和管理的重大需求。
病原體核酸分子檢測(cè)
自PCR技術(shù)面世以來(lái),核酸檢測(cè)在感染病診治中起到重要作用,尤其在結(jié)核分枝桿菌、苛養(yǎng)菌、病毒感染等領(lǐng)域,高靈敏PCR方法在疾病診斷上有決定性作用。但是,傳統(tǒng)PCR技術(shù)需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件和較高的人員技術(shù)要求。雖然PCR反應(yīng)耗時(shí)通常僅2~3 h,但批量檢測(cè)的要求使得大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告周期都在1 d以上。因此,POCT分子診斷成為新興的研發(fā)熱點(diǎn)。
微流控(microfluidics)是一門在微米尺度結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體的技術(shù)與科學(xué)。近年逐步從研發(fā)實(shí)驗(yàn)室走向臨床,成為新一代POCT主流技術(shù)。微流控芯片具有樣品及試劑消耗少、分析時(shí)間短、微型化、集成化、自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì),尤其核酸分析整合了從細(xì)胞裂解、核酸提取擴(kuò)增到產(chǎn)物分析的全部測(cè)定步驟,降低了檢測(cè)的復(fù)雜性,極大推動(dòng)了POCT分子診斷領(lǐng)域的突破性發(fā)展?;诤怂釘U(kuò)增的第一個(gè)獲得CLIA批準(zhǔn)的POCT技術(shù)是Alere流感A/B測(cè)試(2015年),該測(cè)試使用等溫?cái)U(kuò)增和分子信標(biāo)探針技術(shù),15 min完成鼻拭子標(biāo)本的流感病毒A/B檢測(cè)。2017年該公司推出二代產(chǎn)品,將檢測(cè)時(shí)間縮短至5 min。另一項(xiàng)是Roche Cobas Liat系統(tǒng),包括A/B型流感,A群鏈球菌(group A Streptococcus,GAS)和A/B型流感加呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV),檢測(cè)需要15~20 min。目前感染病POCT分子診斷產(chǎn)品最全面的是Cepheid公司,其項(xiàng)目涉及醫(yī)院獲得性感染、危重感染、性健康/女性健康、病毒、等多個(gè)領(lǐng)域。其中Xpert MTB/RIF能在2 h內(nèi)從患者標(biāo)本中直接檢測(cè)出是否含有結(jié)核分枝桿菌及是否對(duì)含有對(duì)利福平耐藥的基因,被WHO推薦用于結(jié)核病的初始診斷。
整合一體化分子檢測(cè)系統(tǒng)可簡(jiǎn)化樣本檢測(cè)流程、縮短檢測(cè)時(shí)間、有效防止交叉污染,在檢測(cè)性能上較抗原抗體檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì),但其配套設(shè)備和試劑的高成本限制了在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)的推廣應(yīng)用。同時(shí),由于一種試劑盒檢測(cè)的靶標(biāo)病原較為單一,對(duì)不同種類病原體需要逐一檢測(cè),在緊急情況下難以滿足需求且多次檢測(cè)給患者醫(yī)療費(fèi)用控制帶來(lái)不利。
因此,高通量、多靶標(biāo)病原體檢測(cè)成為臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展的新目標(biāo)。法國(guó)生物梅里埃Filmarray檢測(cè)系統(tǒng),在微流控芯片中分配出相對(duì)獨(dú)立的多反應(yīng)腔體,在每一個(gè)反應(yīng)腔體中實(shí)現(xiàn)獨(dú)立反應(yīng),從而達(dá)到多重反應(yīng)的效果,實(shí)現(xiàn)了在單次反應(yīng)中的多種病原體核酸檢測(cè),該系統(tǒng)目前具有血流感染、呼吸道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和胃腸道感染多重病原檢測(cè)試劑盒。納米技術(shù)(量子點(diǎn))和微流控技術(shù)的結(jié)合進(jìn)一步推動(dòng)了這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。通過(guò)納米微流控芯片,可以使樣品使用量低至100 μl,靈敏度達(dá)FDA目前批準(zhǔn)技術(shù)的50倍以上。一種新型集成納米微流控芯片,可實(shí)現(xiàn)血清樣品中HIV、HBV和HCV的高通量、多重檢測(cè)。國(guó)內(nèi)博奧生物的呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增芯片法)可在2 h內(nèi)檢測(cè)8種下呼吸道病原體。復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的便攜式微流控恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀(SC-MA2000,滬浦械備20170070號(hào)),可實(shí)現(xiàn)多重病原體同步檢測(cè)。
抗菌藥物敏感性測(cè)定
除了病原體檢測(cè),快速準(zhǔn)確的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility test, AST)在感染病診治中至關(guān)重要。最近的研究展示了用于藥敏檢測(cè)的生物傳感器和微流體裝置的開(kāi)發(fā)。Mach等通過(guò)在有/無(wú)抗菌藥物的情況下在微流控芯片中直接培養(yǎng)臨床尿液標(biāo)本,然后檢測(cè)16S rRNA水平測(cè)量細(xì)菌生長(zhǎng);斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)建立了一種基于微流通道的毛細(xì)阻力的藥敏檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)變動(dòng)流體毛細(xì)阻力通道的長(zhǎng)度來(lái)改變液體流速,從而實(shí)現(xiàn)抗生素的濃度梯度。不同濃度的抗生素再進(jìn)入后續(xù)的細(xì)菌培養(yǎng)腔,從而進(jìn)行藥敏試驗(yàn)?;谠撈脚_(tái)的藥敏試驗(yàn)只要3 h。另一個(gè)微流體AST平臺(tái)是基于生物合成的應(yīng)激激活途徑,可準(zhǔn)確測(cè)定16株金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的敏感性。這些方法目前尚在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段,一旦成熟將可大大縮短目前的藥物敏感試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)抗感染治療。
展望
感染病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷技術(shù)是當(dāng)前轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn),不斷推陳出新。但是,目前取得CFDA批準(zhǔn)的POCT診斷產(chǎn)品仍然以抗原抗體檢測(cè)為主,分子診斷設(shè)備及試劑并不多見(jiàn)。兼具高敏感性和特異性的POCT分子檢測(cè)方法仍然是研發(fā)重點(diǎn),具有潛力。盡管微流控技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯,目前用于臨床感染病診斷仍然需要克服如下瓶頸:(1)樣品處理。臨床檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)能有效處理更廣泛的標(biāo)本類型,如尿液、全血、唾液等;(2)研究設(shè)計(jì)上的創(chuàng)新概念與臨床驗(yàn)證之間存在差距,微流控分子診斷平臺(tái)的參數(shù)優(yōu)化和應(yīng)用評(píng)價(jià)仍需規(guī)范;(3)在資源有限的環(huán)境中POCT技術(shù)需要考慮的關(guān)鍵設(shè)計(jì)特征,如使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增以消除對(duì)熱循環(huán)的需要,使用干粉試劑以保證在高溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定,以及便于基層操作人員的簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)步驟等。同時(shí),POCT的定位仍然是以家庭、社區(qū)、急診和野外緊急救治等感染病檢測(cè)為主,作為中心實(shí)驗(yàn)室確診試驗(yàn)的初級(jí)篩查依據(jù)。選擇合適的時(shí)間、合適的場(chǎng)所、正確地應(yīng)用,POCT作為傳統(tǒng)感染病診斷技術(shù)的有力補(bǔ)充,將為分級(jí)診療模式下的感染病診治提供新的策略。