文章來源：《中國醫(yī)療器械信息》

作者簡介：單萬水，教授，主任技師。廣東省臨床重點?？茩z驗科主任，深圳市第三人民醫(yī)院院士工作站主任，深圳市醫(yī)學(xué)會檢驗專委會副主任委員，深圳市醫(yī)師協(xié)會檢驗分會副會長。

內(nèi)容提要：文章對目前現(xiàn)場快速檢驗（Point-of-Care Testing,POCT）市場上的各種主流技術(shù)進行概述，集中討論POCT市場占比最大的技術(shù)平臺—免疫層析技術(shù)，根據(jù)其工作原理和制造過程，從基本的物理、化學(xué)原理出發(fā)討論影響檢測結(jié)果的主要因素，并從生產(chǎn)、應(yīng)用層面探討實現(xiàn)可靠檢測的關(guān)鍵手段，進而針對目前精準(zhǔn)醫(yī)療、個性化醫(yī)療的市場需求探討POCT技術(shù)的發(fā)展方向和最新出現(xiàn)的技術(shù)平臺—基于生物芯片的微流控技術(shù)，最后就POCT市場上的現(xiàn)有及未來技術(shù)平臺進行綜合分析。

現(xiàn)場快速檢驗（Point-of-Care Test, POCT），也稱即時檢驗，國際上通稱的POCT，是體外診斷行業(yè)增長最快的領(lǐng)域。被廣泛使用的血糖儀即為最成功的POCT產(chǎn)品，占有整個POCT市場60%以上的份額^[1]。目前市場上最有代表性的兩種便攜式POCT技術(shù)是膠體金（或熒光）免疫層析技術(shù)和熒光免疫毛細(xì)技術(shù)。前一種以多家中國公司的產(chǎn)品為代表，后一種以美國Alere公司的Triage產(chǎn)品系列為代表。免疫層析技術(shù)起始于上世紀(jì)80年代初，而Triage產(chǎn)品的開發(fā)始于上世紀(jì)90年代，都已有了二三十年的歷史^[2]。近兩年來，中國、美國等世界上主要國家都在大力推行精準(zhǔn)醫(yī)療、并已把精準(zhǔn)醫(yī)療定位為長期戰(zhàn)略發(fā)展方向。精準(zhǔn)醫(yī)療首先需要精準(zhǔn)診斷，這就對醫(yī)療檢測儀器的性能提出了全新的要求。在此大背景下，兩項關(guān)鍵技術(shù)在醫(yī)療檢測行業(yè)迅速發(fā)展，一個是生物芯片技術(shù)，另一個是微流控技術(shù)。理邦m16磁敏免疫分析系統(tǒng)（生產(chǎn)單位：深圳市理邦精密儀器股份有限公司，簡稱理邦）是其中一個具有代表性的產(chǎn)品。它把微陣列生物芯片集成進了微流體器件里面。其生物芯片是一個多層納米膜結(jié)構(gòu)的微陣列、是通過大規(guī)模集成電路工藝制造的。相對于傳統(tǒng)意義上以玻璃片為基底、以熒光材料為標(biāo)記物的基因芯片，m16上的生物芯片是在單晶硅片上實現(xiàn)的、通過量子力學(xué)現(xiàn)象傳感的技術(shù)。其微流控技術(shù)依賴于機械機構(gòu)對被測樣本和測試試劑實現(xiàn)精確控制。本文對層析熒光技術(shù)、毛細(xì)熒光技術(shù)和微流控生物芯片技術(shù)進行詳細(xì)分析，對3個平臺的技術(shù)特點進行討論，并對它們的發(fā)展方向和應(yīng)用進行探索。

圖1所示的是膠體金免疫層析測試卡的結(jié)構(gòu)，由樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊構(gòu)成。其中，膠體金顆粒上修飾有檢測抗體，硝酸纖維素膜上有檢測線和控制線。檢測時，被測樣本在毛細(xì)作用下通過膠體金標(biāo)記的抗體，形成抗原抗體膠體金復(fù)合物，復(fù)合物繼續(xù)爬行，通過包被有捕捉抗體的檢測線，形成雙抗體夾心膠體金復(fù)合物，在檢測線處呈現(xiàn)色帶。過量的膠體金抗體流過檢測線，在之后的控制線上形成膠體金免疫復(fù)合物，呈現(xiàn)色帶。需要注意的是，控制線上色帶的形成與被檢測物質(zhì)的存在與否無關(guān)，即使樣本里沒有被檢測的物質(zhì)，控制線也會顯現(xiàn)。這種“捕捉抗體-抗原-檢測抗體-膠體金納米顆粒標(biāo)記物”復(fù)合結(jié)構(gòu)被稱為雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，膠體金為指示標(biāo)記。最典型的產(chǎn)品是“早早孕”試紙條，采用雙抗體夾心一步法技術(shù)，以膠體金為指示標(biāo)記檢測尿液中的人絨毛膜促性腺激素（Human Choionic Gonadotophin，HCG）濃度，以判斷受檢者是否受孕。

圖1?免疫層析技術(shù)原理

檢測線上的信號強度也即測試結(jié)果可以由公式（1）計算^[3]：

其中k是一個和抗體-抗原之間親和力有關(guān)的常數(shù)，t是樣本在反應(yīng)區(qū)的駐留時間，Ab是檢測線上捕捉抗體的濃度，Ag是被測樣本中被測物質(zhì)的濃度。

常數(shù)k也和反應(yīng)條件如pH值、溫度等有關(guān)系。從化學(xué)反應(yīng)的角度來看，溫度從25℃降低到15℃，反應(yīng)速度降低50%。抗體抗原反應(yīng)的最佳溫度是37℃，一般1~2h就可以達到峰值。如果在4℃反應(yīng)，達到峰值時間會長達12~24h。所以檢測過程應(yīng)該盡量保持在同一個溫度下進行，否則室內(nèi)溫度的變化會帶來很大的影響。

當(dāng)樣本體積一定時，樣本在反應(yīng)區(qū)的駐留時間t和流速成反比。流速增加一倍，信號值就降低75%。樣本的流動速度可以由公式（2）計算^[4]：

其中k是所用材料（這里主要指硝酸纖維素膜）的滲透率，

公式（2）中另一個重要參數(shù)是x，也就是檢測線的位置。x值越小，檢測線離樣品墊越近，流速也就越大，這樣反應(yīng)上的被測物質(zhì)就越少。由此可見，檢測線的位置是一個非常重要的設(shè)計參數(shù)，制造過程中需要嚴(yán)格的控制。值得注意的是，檢測線的位置是相對于樣品墊和膠體金結(jié)合墊來講的，所以除了需要精密控制檢測線在硝酸纖維素膜上的位置，對樣品墊和膠體金結(jié)合墊尺寸和位置的控制同樣重要。

如果樣本量發(fā)生變化，則公式（1）中的駐留時間t也會發(fā)生變化。尤其是當(dāng)樣本量太少時，樣本很快的流出反應(yīng)區(qū)，被測物質(zhì)沒有足夠的時間和捕捉抗體進行反應(yīng)、結(jié)合，導(dǎo)至測試結(jié)果低于正常期望值。當(dāng)樣本量過多時，吸水墊可以起到一定的調(diào)節(jié)作用，飽和以后可以有效阻擋樣本的繼續(xù)流動。但是，駐留在檢測線上沒有流走的被檢測物還會繼續(xù)和捕捉抗體反應(yīng)，直到結(jié)合過程和分解過程達到一個平衡。但是，這個平衡是和其他條件如溫度有關(guān)系的。在這種情況下，嚴(yán)格的控制檢測時間和環(huán)境溫度就變得非常重要。

圖1所示的免疫層析器件看似非常簡單,但實際上卻是一個非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，影響其檢測結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性的因素眾多，這也是多年來此項技術(shù)只用在定性判定上的原因。技術(shù)儲備雄厚的公司已經(jīng)有了定量檢測產(chǎn)品，但是批間差、卡間差仍是一個大的挑戰(zhàn)。如果用S表示檢測結(jié)果信號強度，S可以用表達式（3）描述：

表達式（3）：S=f?[Y（樣品墊），J（膠體金墊）,?J_j（膠體金顆粒），X（硝酸纖維素膜）,?Ab（抗體）,?M（制造過程）]????

即最后的信號強度受樣品墊、膠體金墊、膠體金顆粒、硝酸纖維素膜、抗體、以及制造過程的影響。而以上列舉的每一項變量又受多個因素的影響。舉例來講，影響樣品墊特性的因素可以由表達式（4）描述：

表達式（4）：Y（樣品墊）?=f_y?（材料，蛋白質(zhì)，緩沖劑，洗滌液，表面活性劑，黏度調(diào)節(jié)劑，制造過程）

表達式（4）中的材料可以是纖維素膜，也可以是網(wǎng)狀織物，但它們有很大差別。舉例來講，網(wǎng)狀織物可以較薄、機械強度較好、耐拉、存留體積（可保留液體體積）小，但是確難以在上面加足夠量的化學(xué)試劑來調(diào)節(jié)樣本中的蛋白成分、pH值、離子強度、黏稠度等，也就是說表達式（4）右側(cè)中的第2、3、4、5、6項的調(diào)節(jié)就比較困難。纖維素濾膜的特點和網(wǎng)狀織物幾乎完全相反：較厚、存留體積大、強度小、很難操作。因為存留體積大，所以有足夠的空間來在上面修飾各種化學(xué)試劑。組裝對纖維素濾膜是一個關(guān)鍵的因素，必須確保和膠體金顆粒墊有良好、一致的接觸，否則會嚴(yán)重影響被測樣本向前流動，這就是表達式（4）右側(cè)第七項（制造過程）所涉及的內(nèi)容。

表達式（4）中的第二項（蛋白質(zhì)）的主要作用是封閉樣品墊、防止樣本中的被測物質(zhì)因為非特異吸附力而被吸附在樣品墊上、不能被檢測線檢測。另外，如果樣品墊上封閉蛋白的量和配比合適的話，硝酸纖維素膜就可以不必再封閉，使成本和操作復(fù)雜性大大降低。同一個測試卡產(chǎn)品可能被用來測試多種不同的樣本，例如血清、血漿、全血、甚至尿液，緩沖液可以被用來調(diào)節(jié)樣本的pH值，在一定程度上使不同樣本中的同種被測物質(zhì)在檢測線上的反應(yīng)性保持一致。舉例來講，尿液的pH值可以在5～10的大范圍內(nèi)變化，同樣濃度的被測物質(zhì)在不同的pH值環(huán)境下的反應(yīng)性會有很大不同，緩沖試劑可以比較有效的降低這種變化。

表達式（4）中右側(cè)第六項（黏度調(diào)節(jié)劑）的作用非常重要。由公式（2）可知，樣本的黏度對樣本流動的速度有直接影響，而由表達式（1）又可以看出樣本流動的速度對檢測結(jié)果的影響又進一步放大。所以，控制樣本的黏度非常關(guān)鍵。黏度調(diào)節(jié)劑的作用是調(diào)節(jié)不同樣本的黏度，使它們在硝酸纖維素膜上流動的速度盡可能相同。

硝酸纖維素膜是使用者可以觀察到的另一個部件，也是免疫層析器件上最重要的一個部分。影響它性能的因素可以由表達式（5）描述：

表達式（5）：X（硝酸纖維素膜）=f_x?（最大孔隙尺寸，孔隙尺寸分布，孔隙占比，封閉劑，緩沖液，表面活性劑）? ? ? ? ?

硝酸纖維素膜最重要的性能參數(shù)是試劑在其中的流速，這主要由表達式（5）中右側(cè)的前3項決定。在最大孔隙尺寸以及孔隙尺寸分布相同的前提下，流速和孔隙占比大約成正比關(guān)系。這里面最大的挑戰(zhàn)是用宏觀的過程控制微觀的關(guān)鍵參數(shù)。硝酸纖維素膜一般是成卷生產(chǎn)的，卷的寬度是幾十厘米，每一卷材的長度是100m。生產(chǎn)過程需要把這樣大面積的原材料切割成大約為4mm×40mm的測試條的尺寸，同時保證每個條之間的一致性。此外，測試條邊沿需要保持直線形狀、測試條表面不能被接觸或污染。這樣一個生產(chǎn)過程所造成的結(jié)果是，同一大張“紙”上切割出來的測試卡的一致性會比較好，但是，控制批間差就要困難很多。

圖2所示是免疫層析產(chǎn)品的生產(chǎn)過程。首先在大張層析膜上噴畫控制線和檢測線，然后把此大張層析膜粘貼在支撐底襯上。這個過程必須要確保底襯和膜的接觸緊密、均勻一直，否則將會導(dǎo)至不同測試條（卡）之間的液體流動速度和方式有很大的不同。下一步是粘貼膠體金墊、樣品墊和吸水墊。吸水墊和膠體金墊各自和硝酸纖維膜有部分交疊，樣品墊覆蓋了膠體金墊的一部分。這里面最需要注意的是各層之間的交疊、接觸需要密切、均勻，不能在任何膜層表面引入物理變形、污染物、或者化學(xué)雜質(zhì)。很多和液體流動均勻性有關(guān)的問題都和以上這幾個過程有關(guān)。最后一步是在溫度和濕度都受控的房間里，把上面制作的大張材料切割成一條條的試紙條，組裝入塑料殼。

圖2?免疫層析產(chǎn)品的制造過程

從上面的制造過程可以看出，同一大張材料上切割出來的測試卡的一致性會比較好，因為是在同一個時間、同一個環(huán)境條件、用同一片材料、同一次制作過程完成的。比較難以控制的是不同批次間的差別。所以質(zhì)量控制也應(yīng)該主要關(guān)注批間差。

圖3 Biosite微流體測試卡結(jié)構(gòu)

圖3所示是美國Alere公司qixia的Triage產(chǎn)品系列的測試卡結(jié)構(gòu)，其中沒有任何的薄膜材料。它有上下兩層材料組成，兩層材料之間的距離是可以產(chǎn)生毛細(xì)現(xiàn)象的距離。上層為高度透明材料，目的是可以使在兩層材料之間產(chǎn)生的熒光信號不受干擾地傳播到透明材料另一側(cè)的熒光檢測器件上。底層表面的地貌隨需求變化而不同，而最突出的特征就是“搓衣板”地貌。這樣一個“搓衣板”地貌可以有效的增加表面積、增加抗體固定量及固定強度。在測試區(qū)域的表面上修飾的主要是捕捉抗體和封閉試劑，在樣本準(zhǔn)備區(qū)域的不同部位上修飾有熒光標(biāo)記物、檢測抗體、緩沖試劑、封閉試劑等。樣本進入測試卡以后，其中液體溶解各種生化試劑，毛細(xì)作用推動試劑向檢測區(qū)流動。

把一根細(xì)細(xì)的玻璃管的一端垂直放進一個水盤子里，水在玻璃管里面就會因毛細(xì)作用而上升，上升的高度可以由Jurin定律來計算^[4]：

其中

是液體-空氣表面張力，

是液體和玻璃管表面的接觸角度，