什么是化學發(fā)光

化學發(fā)光：在常溫下由化學反應產生的光，產生電子能級處于激發(fā)態(tài)的物質，后者通過躍遷釋放能量產生光子，從而導至的發(fā)光現(xiàn)象。化學發(fā)光是一個多步驟的過程。  

化學發(fā)光按照發(fā)光時間可以分為：

閃光（Flash）: 發(fā)光時間在數(shù)秒內，如吖啶酯，以原位進樣(In Situ Injector) 和時間積分法測量。

輝光（Glow）: 發(fā)光時間在數(shù)十分鐘以上，如：HRP-Luminol系統(tǒng)、AP-AMPPD系統(tǒng)、黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，無須原位進樣，以速率法測量。

什么是化學發(fā)光免疫分析

化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA) 誕生于1977年，是近十年來在世界范圍內發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析，將高靈敏的化學發(fā)光技術與高特異性的免疫反應結合起來建立的微量測定技術，因此該技術靈敏度高、線性范圍寬、應用范圍廣。而且CLIA與放射免疫分析(RIA)、熒光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比，操作簡便、反應快速、無放射污染，儀器簡單穩(wěn)定且可以實現(xiàn)自動化。

化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)示意圖

化學發(fā)光免疫分析包含免疫分析系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。

免疫分析系統(tǒng)是指：抗原抗體標記化學發(fā)光物質或酶，經過抗原與抗體反應形成抗原-抗體免疫復合物。

化學發(fā)光分析系統(tǒng)是指：在免疫反應結束后，利用化學發(fā)光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號測量儀進行檢測。根據(jù)化學發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關系，可利用標準曲線計算出被測物的含量。

    化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)分類

根據(jù)免疫系統(tǒng)的固相載體進行分類，可將化學發(fā)光分為：

• 板式化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，固相載體為微孔板，需要反應時間較長，代表廠家科美、新波等；

• 管式化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，固相載體為微粒子，比較主流的微粒子是微米級別的超順磁微粒。大多數(shù)管式化學發(fā)光為大型免疫分析系統(tǒng)，代表廠家羅氏、雅培、西門子、貝克曼等。國內已有廠家將管式化學發(fā)光應用于POCT。

根據(jù)免疫反應狀態(tài)進行分類，可將化學發(fā)光分為：

• 均相化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)：均相條件下反應和檢測，無需分離系統(tǒng)。比如科美光激化學發(fā)光系統(tǒng)和西門子德靈系統(tǒng)；

• 非均相化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)：主流的化學發(fā)光系統(tǒng)，發(fā)光檢測前，需要將未反應結合的樣品洗脫分離。   

根據(jù)發(fā)光體系的不同進行分類，可將化學發(fā)光分為：化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析、電化學發(fā)光免疫分析法、光激化學發(fā)光免疫分析。本文簡單介紹幾種化學發(fā)光體系：

化學發(fā)光免疫分析（直接化學發(fā)光）

化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA），用化學發(fā)光試劑直接標記抗體或者抗原的一類免疫檢測方法。

• 魯米諾類標記的化學發(fā)光免疫分析：魯米諾類物質的發(fā)光為氧化反應發(fā)光。在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光，其中H₂O₂最為常用。

• 吖啶酯類標記的化學發(fā)光免疫分析：吖啶酯在H₂O₂和OH^-條件下，能迅速發(fā)光，吖啶酯衍生物標記效率高且穩(wěn)定性好，因此吖啶酯作為標記物用于免疫分析，發(fā)光體系簡單、成本低，具有較低本底且能快速檢測。

化學發(fā)光酶免疫分析（酶促化學發(fā)光）

化學發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescent enzymeimmunoassay，CLEIA）屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發(fā)光劑。反應步驟：以酶標記生物活性物質進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP)。

•  HRP-H₂O₂-LUMINOL體系：使用過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應后，利用魯米諾作為發(fā)光底物，在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑（NaOH和H₂O₂）作用下魯米諾發(fā)光，同時加入增強劑，以增強發(fā)光信號。

• ALP-AMPPD發(fā)光體系：AMPPD在堿性條件下本底很低，熱穩(wěn)定性好且檢測結果穩(wěn)定。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有很較高的靈敏度，已得到廣泛應用。

電化學發(fā)光免疫分析

電化學發(fā)光免疫分析（Electrochemiluminescence，ECL）是指由電化學反應引起的化學發(fā)光過程。ECL的反應在電極表面進行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3 ]，以三丙胺(TPA)來激發(fā)光反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。ECL的突出優(yōu)點：標記物非常穩(wěn)定；發(fā)光時間長、靈敏度高、線性范圍寬、反應時間短。羅氏該方法專利已經于2016年過期，目前國內已經有企業(yè)布局該檢測領域。

光激化學發(fā)光免疫分析

光激化學發(fā)光（Light initiated chemiluminescence assay, LiCA）是以納米級高分子微粒為基礎的新一代化學發(fā)光技術。 試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成。LiCA技術的核心原理是高能態(tài)離子氧的產生和傳遞，是由光激發(fā)產生的均相化學發(fā)光技術。它具有低本底、快速、均相（免洗脫）、高靈敏度等優(yōu)點，但是由于是均相反應，適用于兩步法反應的項目在解決假陽性率和消除HOOK效應方面具有較高研發(fā)難度。