化學(xué)發(fā)光技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前免疫診斷市場中最重要的檢測技術(shù)。自上世紀(jì)70年代誕生以來，盡管隨著檢測設(shè)備全自動化水平以及檢測元件精密度、試劑生產(chǎn)保存工藝的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的檢測靈敏度有了顯著的提升，然而究其本質(zhì)而言，無論是酶促發(fā)光、直接發(fā)光或是電化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光技術(shù)在檢測原理上在過去的近50年里并沒有得到任何改變?？梢哉J(rèn)為在自動化水平已經(jīng)達到相當(dāng)高程度的今天，化學(xué)發(fā)光技術(shù)在現(xiàn)有抗體親和力水平的前提下，已經(jīng)接近了其檢測能力的極限。
免疫診斷市場在新型標(biāo)志物或新型診斷市場上的開拓，可能需要一種從檢測原理層面進行變革的新型免疫診斷技術(shù)——單分子免疫檢測。
本文將分為以下幾個部分探討下一代免疫診斷技術(shù)——單分子免疫檢測對現(xiàn)有免疫診斷市場的影響以及在體外診斷市場普及應(yīng)用的可行性。
（1） 化學(xué)發(fā)光發(fā)展現(xiàn)狀
（2） 單分子檢測技術(shù)——生物檢測技術(shù)的極限標(biāo)尺
（3） 從化學(xué)發(fā)光到單分子免疫檢測有多遠(yuǎn)
（4） 數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展給單分子免疫檢測的啟示
（5） 單分子免疫檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀
（6） 單分子免疫檢測平臺技術(shù)分析
（7） 單分子檢測技術(shù)是分子檢測與免疫檢測平臺統(tǒng)一化的可行橋梁
（8） 超低成本單分子免疫檢測技術(shù)實現(xiàn)的可能性
1. 化學(xué)發(fā)光技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀
當(dāng)今全球范圍內(nèi)，免疫診斷市場呈現(xiàn)以大型全自動化學(xué)發(fā)光為主流，多種檢測技術(shù)原理、檢測平臺形式多樣化發(fā)展的局面。
國內(nèi)高端免疫診斷市場中，大型全自動化學(xué)發(fā)光設(shè)備基本處于羅氏、雅培、西門子等國際巨頭企業(yè)壟斷狀態(tài)。盡管邁瑞、新產(chǎn)業(yè)等國內(nèi)龍頭企業(yè)近幾年得到迅速發(fā)展，但是短期內(nèi)依然難以改變目前市場份額分配的局勢。
而在POCT細(xì)分領(lǐng)域，則有以梅里埃VIDAS、三菱PATHFAST、星童Pylon等為代表的小型全自動單人份POCT試劑條，以美艾利爾、廣州萬孚、南京基蛋為代表的免疫層析試紙，以及雅培iSTAT、華邁興微極光系列、理邦的磁敏免疫產(chǎn)品為代表的微流控POCT產(chǎn)品?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)憑借其絕對領(lǐng)先的靈敏度、準(zhǔn)確性與精密度，無疑是當(dāng)前免疫診斷技術(shù)中最可靠的檢測方法，它貫穿了從全自動大型設(shè)備，到小型全自動POCT設(shè)備甚至到微流控POCT的全線免疫診斷產(chǎn)品。
然而，當(dāng)我們對免疫診斷技術(shù)發(fā)展歷史進行梳理時候，就會發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光并不是一個新技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)從上世紀(jì)70年代中期誕生，到上世紀(jì)末以及本世紀(jì)初由于羅氏、雅培、西門子等企業(yè)通過收購或自主研發(fā)推出各大早期化學(xué)發(fā)光平臺而受到廣泛關(guān)注，再到近十年隨著自動化技術(shù)的迅速發(fā)展，替代了酶聯(lián)免疫成為免疫診斷市場最核心的技術(shù)，已經(jīng)經(jīng)歷了超過40年的時間。
而在這40年里，無論是酶促化學(xué)發(fā)光、直接化學(xué)發(fā)光或是電化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光的檢測技術(shù)卻并沒有任何檢測原理層面上的改變，現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光檢測在靈敏度、準(zhǔn)確度的提升幾乎是完全依賴于自動化設(shè)備精密度的提升以及發(fā)光分子衍生物結(jié)構(gòu)上的改造。
在過去化學(xué)發(fā)光技術(shù)快速發(fā)展的近二十年里，我們習(xí)慣了依賴于自動化技術(shù)快速發(fā)展給免疫診斷市場帶來的精確度與可靠性的提升，卻也習(xí)慣了化學(xué)發(fā)光方法在檢測技術(shù)原理上給我們帶來試劑或設(shè)備層面的各種枷鎖，形成了定式思維，難以在檢測原理層面實現(xiàn)革新。
2. 單分子檢測技術(shù)——生物檢測技術(shù)的極限標(biāo)尺
1967年法國數(shù)學(xué)家B.B.Mandelbrot在其分形理論中提出了“英國的海岸線有多長”的問題。該理論認(rèn)為，英國海岸線的長度取決于測量尺子的精確程度。隨著尺子逐漸變小，精確程度逐漸提高，測量所得的海岸線長度將無限增大。與“英國海岸線有多長”的問題相似，我們對生命科學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)知范圍也是隨著各種生物檢測技術(shù)靈敏度和精確程度的提升而逐漸提升的。
不同的是，在生物分析檢測領(lǐng)域，尺子的最小尺寸似乎是有極限的——單分子水平。包括核酸、蛋白質(zhì)或是多糖在內(nèi)的絕大部分生物分析系統(tǒng)，當(dāng)檢測對象超越了分子水平到達原子水平，檢測都將失去其本來的意義。單分子水平的生物標(biāo)志物的研究，為前沿科學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)療診斷領(lǐng)域都提供了難以估量的學(xué)術(shù)價值與市場機會。
3. 從化學(xué)發(fā)光到單分子免疫檢測有多遠(yuǎn)
圖1 吖啶酯發(fā)光過程中的光子方向隨機性
現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)是一種自上而下的檢測邏輯，它通過測量溶液整體光學(xué)信號強度換算分子濃度。以吖啶酯化學(xué)發(fā)光為例，化學(xué)發(fā)光設(shè)備通常是以光電倍增管（PMT）直接檢測溶液整體釋放的光子數(shù)，通過積分或發(fā)光強度的形式來實現(xiàn)定量檢測?，F(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光體系為了提高吖啶酯化學(xué)發(fā)光檢測體系的靈敏度，除了抗體親和性因素的影響，更為簡單直接的方法就是提高反應(yīng)體系的整體體積，從而在一定樣品濃度下提高檢測液中結(jié)合的吖啶酯分子的總數(shù)，來提高被PMT檢測到的光子總數(shù)。然而這種檢測形式并不適合于單分子水平的檢測。
要實現(xiàn)單分子免疫檢測必須要實現(xiàn)兩個前提：
（1）單分子信號檢測
（2）單分子信號溯源。
前者是單分子檢測的基礎(chǔ)條件，而后者則是通過單分子計數(shù)實現(xiàn)定量檢測的必須條件。
現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)不可能實現(xiàn)單分子免疫檢測，其檢測靈敏度下限的瓶頸來源于分子層面的不確定性。吖啶酯分子在遇到發(fā)光激發(fā)底物時，會在極短的時間內(nèi)釋放數(shù)個光子，其后結(jié)構(gòu)迅速遭到破壞失去發(fā)光能力。由于吖啶酯分子在釋放光子時，光子方向是不可控的，而作為發(fā)光檢測設(shè)備的核心部件光電倍增管卻是有方向性的（圖1）。這就使得單個吖啶酯釋放的少數(shù)幾個光子不能確保被PMT檢測到（不滿足第一點前提條件），同時PMT上捕獲的光子信號也不可能對溶液中單個吖啶酯分子進行溯源（不滿足第二點前提條件）。
當(dāng)樣品中的抗原分子濃度低到一定程度時，PMT能夠捕獲到光子數(shù)量的不確定性將呈指數(shù)級提高，導(dǎo)至檢測信號完全被埋沒于背景噪音中，失去定量檢測能力。同樣的問題也存在于電化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光體系中。
因此，在設(shè)備自動化技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到相當(dāng)高水平的今天，現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測靈敏度已經(jīng)接近于其理論上的檢測極限水平。
對于現(xiàn)有的免疫檢測體系而言，若需要以更高靈敏度的檢測方法去探尋新的生物標(biāo)志物，或是開發(fā)新型免疫診斷市場方向，勢必需要在檢測原理層面上進行技術(shù)本質(zhì)的革新。
4. 數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展給單分子免疫檢測的啟示
圖2 數(shù)字PCR工作原理
（PNASAugust 3, 1999 96 (16) 9236-9241; DOI: pnas.96.16.9236）
在過去的近二十年里，數(shù)字PCR技術(shù)快速發(fā)展可以認(rèn)為是分子診斷領(lǐng)域最令人振奮的技術(shù)進步。數(shù)字PCR技術(shù)（DigitalPCR）最早由Vogelstein于1999年提出，通過在96/384孔板中極限稀釋DNA模板進行驗證（圖2）。
2003年Dressmam等發(fā)明了BEAMing技術(shù)，將磁珠、模板、引物等分散到小液滴當(dāng)中，進行單分子級別的擴增，再利用磁珠對單分子擴增產(chǎn)品進行結(jié)合回收分析。
2006年Fluidigm推出了第一臺基于微陣列芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。同年QuantaLife推出液滴式數(shù)字PCR技術(shù)，并于2011年被Bio-Rad公司以1.62億美元收購，成為后來眾所周知的QX-100系統(tǒng)，正式掀起了數(shù)字PCR在資本市場中的熱潮。
2013年Bio-Rad推出升級機型QX-200系統(tǒng)。同年，LifeTechnologies推出了基于微陣列液滴芯片的QuantStudio3D系統(tǒng)，成為QX-200系統(tǒng)主要市場競爭對手。此后，受益于資本市場對數(shù)字PCR下一代分子診斷技術(shù)地位的認(rèn)可和推動，國內(nèi)外涌現(xiàn)了一大批各式數(shù)字化PCR技術(shù)平臺。
2016年，法國Stilla公司推出了NaicaCrystal平臺，首次推出了三色檢測通道的數(shù)字PCR系統(tǒng)。2017年，伯樂完成對競爭對手RainDanceTechnologies的收購，基本完成在液滴式數(shù)字PCR細(xì)分技術(shù)領(lǐng)域的壟斷。
數(shù)字化PCR技術(shù)的發(fā)展不僅推動了現(xiàn)有的分子診斷體系的進步，更為將來分子診斷市場在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，例如基因組拷貝數(shù)突變、低豐度DNA模板檢測、二代測序輔助建庫、腫瘤治療伴隨檢監(jiān)測、稀有致病菌檢測等，提供了必要的技術(shù)支持。
數(shù)字PCR是當(dāng)前市場上最具有代表性的單分子檢測技術(shù)，它是一種典型的信號放大依賴型的單分子檢測技術(shù)，其本質(zhì)是單分子獨立的信號放大、識別與提取。數(shù)字PCR通過將樣品分散到數(shù)萬至數(shù)十萬個獨立反應(yīng)單元（液滴或陣列），在每個反應(yīng)單元中對模板分子進行獨立擴增。擴增后通過測量反應(yīng)單元熒光信號強度判斷該單元是否含有模板分子，再根據(jù)含有模板分子的反應(yīng)單元所占比例來換算樣品中模板分子的濃度。
數(shù)字PCR的核心理論依據(jù)是泊松分布（Poissondistribution）。泊松分布是一種統(tǒng)計與概率學(xué)里常見到的離散概率分布，它描述了單位時間內(nèi)隨機事件發(fā)生次數(shù)的概率。對于數(shù)字PCR檢測體系則是描述了在一定模板濃度的前提下（λ表示平均每個微單元平均出現(xiàn)的模板個數(shù)），在每個固定體積的微反應(yīng)器（液滴或微陣列單元）中出現(xiàn)模板個數(shù)的概率。根據(jù)泊松分布公式，當(dāng)目標(biāo)濃度稀釋到極限，λ遠(yuǎn)小于1趨近于0時，趨近于0，P（1）趨近于λ，故可通過絕對計數(shù)來實現(xiàn)絕對定量。
目前，市場上比較具有代表性的幾個數(shù)字PCR技術(shù)平臺及其主要技術(shù)特點如下表所示：
表1 幾個具有代表性的數(shù)字PCR技術(shù)平臺特點匯總
數(shù)字PCR技術(shù)對現(xiàn)有傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)的沖擊，以及技術(shù)層面上單分子檢測的策略方法，讓一些人注意到了將單分子檢測技術(shù)應(yīng)用到體外診斷領(lǐng)域中，占據(jù)最大市場份額的免疫診斷的潛力。盡管近幾年國內(nèi)數(shù)字PCR技術(shù)的開發(fā)與推廣依然處于如火如荼的快速發(fā)展階段，國外更具有先進性戰(zhàn)略眼觀的企業(yè)與資本市場早已將啟動了單分子檢測技術(shù)在免疫診斷市場的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化。
2010年，參考數(shù)字PCR檢測原理，DavidWalt與David Duffy團隊開發(fā)了“DigitalELISA”技術(shù)（Single-moleculeenzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolarconcentrations, Nature Biotechnology, volume28, pages595–599 (2010)）。該技術(shù)延續(xù)了數(shù)字PCR單分子檢測邏輯，它以標(biāo)記后的半乳糖苷酶催化底物產(chǎn)生熒光信號代替數(shù)字PCR過程中PCR進行信號擴增的過程，將標(biāo)記有β半乳糖苷酶的單分子蛋白分散到高通量的微反應(yīng)器中進行獨立反應(yīng)，通過對每個微反應(yīng)器信號的檢測和統(tǒng)計來實現(xiàn)單分子級別檢測。
“DigitalELISA”技術(shù)的出現(xiàn)打破了業(yè)內(nèi)對免疫檢測技術(shù)檢測靈敏度下限的認(rèn)知，讓業(yè)內(nèi)意識到單分子免疫檢測技術(shù)在醫(yī)療診斷市場產(chǎn)業(yè)化的可行性。其后，DavidWalt憑借“Digital ELISA”技術(shù)于美國成立Quanterix公司，推出單分子酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)平臺SiMoA。SiMoA一經(jīng)面世便吸引了眾多國內(nèi)外業(yè)內(nèi)人員和資本市場的關(guān)注，并在其后的幾年內(nèi)獲得多倫高額的融資。
2015年，Merck公司收購Singulex公司SMC技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的使用權(quán)（金額條件未披露），再次將單分子免疫檢測技術(shù)推到資本市場的大舞臺。而隨著今年Merck公司主推的穩(wěn)定性更好的第二代單分子蛋白檢測平臺SMCxPRO系統(tǒng)的大力推進，勢必將引起一陣單分子免疫檢測技術(shù)發(fā)展的熱潮。
數(shù)字PCR技術(shù)的快速發(fā)展在技術(shù)層面上給了單分子免疫檢測技術(shù)很好的啟示和推動作用，它在過去幾年里發(fā)展的歷程也讓我們意識到單分子檢測作為下一代檢測技術(shù)在體外診斷市場中勢不可擋的發(fā)展趨勢。
可以預(yù)測，如果說數(shù)字化PCR正處于體外診斷資本市場的風(fēng)口之上，那么下一個進入體外診斷技術(shù)領(lǐng)域風(fēng)口的有可能是單分子免疫檢測技術(shù)。
