WB(Western Blot)實驗是定性、定量檢測蛋白表達的一種經(jīng)典、有效的技術方法。WB的優(yōu)點是靈敏，可達ng級別,用ECL顯色法可達pg級別，方便，特異性高，但是WB實驗步驟繁多，操作復雜，許多朋友在做WB實驗時吐槽總會遇上這樣那樣的問題：WB檢測信號弱、檢測不到條帶、有非特異條帶、背景深等等，導致無法獲得想要的WB圖片。對此：預防為主，嚴格按要求做好每一步。下面根據(jù)我們實驗的經(jīng)驗為大家整理了常見的WB實驗問題以及相應處理方法，希望能幫助大家獲得想要的漂亮WB圖片結果，如有補充，歡迎留言。
01?無條帶
1.??抗體不夠?？贵w對目標蛋白的親和力可能較低或活性降低，建議增加抗體濃度(比建議的起始濃度高2-4倍)。也可能是抗體失去活性，需要換新的抗體。
2.??樣本中蛋白含量低。建議使用陽性對照樣本確定實驗的有效性，提高蛋白上樣量，用其他方法確定樣本中目的蛋白的存在。
3.??轉(zhuǎn)膜失敗。確保NC或者PVDF膜與凝膠之間有良好的接觸。
4.??轉(zhuǎn)膜不完全。建議優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時間，高分子量蛋白需要更長時間。為了保證轉(zhuǎn)膜完全，建議用麗春紅，酰氨黑，印度墨水染膜?；蚴褂妙A染marker。
5.??轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)過了。降低低分子量蛋白質(zhì)(< 10 kDa)的轉(zhuǎn)移電壓或時間。
6.??蛋白等電點大于9。建議使用pH值較高的替代緩沖系統(tǒng)，如CAPS (pH 10.5)。
7.??二抗使用錯誤。確認二抗的宿主和亞型。
8.??抗體過期。建議更換新鮮抗體。
9.??抗體儲存不當。按照供應商建議儲存，避免反復凍融。
10.疊氮化鈉污染。確保緩沖液不含疊氮化鈉，因為疊氮化鈉會抑制HRP信號。
11.抗體孵育時間不夠。建議4℃過夜孵育一抗。
02?條帶弱
1.??蛋白和抗體結合較弱。建議減少洗滌次數(shù)，降低抗體稀釋液和洗液中的NaCl濃度(推薦范圍為0.15M - 0.5M)。
2.??抗體不夠?？贵w對目標蛋白的親和力可能較低或活性降低，建議增加抗體濃度(比建議的起始濃度高2-4倍)
3.??蛋白量不夠。建議提高樣本上樣量。
4.??偶聯(lián)物活性降低。建議把酶和底物在一個管子中混合，如果沒有顯色或者很弱，需要更換新的試劑做實驗。
5.??ECL試劑失效，建議更換新的ECL試劑。
6.??脫脂奶粉可能會封閉一部分抗原。建議降低封閉液和抗體稀釋液中奶粉的含量或者用3%BSA代替。
03?多條帶
1.??一抗的非特異結合。建議降低一抗?jié)舛?，減少蛋白上樣量，或者更換特異性更高的單抗。
2.??二抗的非特異結合。不加一抗，僅用二抗做對照，如果出現(xiàn)條帶就選擇其他二抗。
3.??一抗或二抗的非特異結合。建議在一抗或二抗溶液中加入0.1 - 0.5% Tween20，提高洗液Tween20含量（0.1%-0.5%），增加洗膜次數(shù)，提高抗體稀釋液和洗液中的NaCl濃度(0.15M - 0.5M)。
4.??蛋白的聚集。建議增加DTT用量(20 -100mM DTT)，保證二硫鍵完全還原。上樣前在沸水中加熱5-10分鐘，并進行短暫的離心。
5.??蛋白的降解。建議避免樣本的反復凍融，樣本儲存前加入蛋白酶抑制劑或者使用新鮮樣本。
6.??試劑污染。檢查緩沖液中是否有微粒或細菌污染，使用新鮮的試劑。
04?高背景
1.??一抗的非特異結合。建議降低一抗?jié)舛?，?%優(yōu)質(zhì)脫脂牛奶封閉，調(diào)整一抗溶液中脫脂奶粉含量（2%-5%）或者NaCl濃度(0.15M - 0.5M)，或者更換特異性更高的單抗。
2.??二抗的非特異結合。不加一抗，僅用二抗做對照，如果出現(xiàn)條帶就選擇其他二抗。
3.??封閉不完全。在含有5%脫脂奶粉的封閉液中加入0.1%- 0.5% Tween 20，適當延長封閉時間。4℃封閉過夜可能降低封閉效果。
4.??脫脂奶粉可能會封閉一部分抗原。建議用3%BSA代替。
5.??脫脂奶粉含有內(nèi)源性生物素，與親和素/鏈霉親和素不相容。建議用3%BSA代替。
6.??一些抗體可以識別牛奶蛋白。建議用3%BSA代替。
7.??洗膜不充分。建議增加洗滌次數(shù)，提高洗液Tween20含量（0.1%-0.5%）。
8.??膠片曝光過度。建議降低曝光時間，如果目標信號太強，等待5-10分鐘，重新曝光到膠片上。
05?白色條帶
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過度的信號生成。建議降低抗體或蛋白濃度，過量的抗體或蛋白可引起極高水平的局部信號(通常是一條帶)。這導致在這一點上底物的快速、完全消耗，由于這個反應完成后沒有光產(chǎn)生，所以當暴露在膠片上時，就會產(chǎn)生白色的條帶。
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ECL顯色劑過于靈敏，或者發(fā)光時間太短。建議更換低靈敏度的ECL顯色劑。
06?出現(xiàn)斑駁不平的斑點
1.??試劑的污染。檢查緩沖液中是否有微?；蚣毦廴荆褂眯迈r的試劑。
2.??孵育或洗滌的溶液不夠。確保膜完全浸泡到洗液或孵育液中。
3.??在膜中有氣泡。輕輕去除所有氣泡。特別是在轉(zhuǎn)膜過程中。
4.??孵育過程中攪拌不均勻。通過放置在搖動器上確保攪拌均勻。
5.??設備污染。確保電泳裝置正確清洗。殘留的蛋白質(zhì)或凝膠碎片可能會粘附在膜上，徹底洗膜。
6.??曝光過度。建議減少曝光時間。