導(dǎo)讀
免疫是人類健康的第一道防線，是防衛(wèi)病原體入侵最有效的武器。今天談?wù)劶?xì)菌或古生菌的免疫。細(xì)菌免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了技術(shù)革命浪潮并產(chǎn)生了極大的社會(huì)影響。
新發(fā)現(xiàn)的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9，使得CRISPR系統(tǒng)在病原體的快速診斷和腫瘤基因檢測領(lǐng)域的應(yīng)用成為可能，本期我們重點(diǎn)關(guān)注“新魔剪”Cas12a，看看它如何瘋狂切割單鏈DNA，實(shí)現(xiàn)對腫瘤基因或特定病原體的檢測。
CRISPR-Cas系統(tǒng)背景回放
面對噬菌體的威脅，細(xì)菌進(jìn)化出了一套專門針對噬菌體或外源性遺傳物質(zhì)的CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)。CRISPR全稱為“簇狀、規(guī)律間隔的、短回文重復(fù)序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是由眾多短而保守的重復(fù)序列區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）組成。如圖1所示: Repeat是細(xì)菌固有序列，能夠同時(shí)結(jié)合Cas蛋白和spacer的序列，而spacer則是細(xì)菌（或是其祖先）感染過的病毒序列。一旦噬菌體感染發(fā)生，絕大多數(shù)的細(xì)菌死亡，極少部分的細(xì)菌由于其基因變異得以生存。這些細(xì)菌中的一部分，將噬菌體的DNA序列切割后，插入repeat區(qū)域中，形成spacer，從而獲得類似高等生物“免疫記憶”的能力。
圖解CRISPR-Cas系統(tǒng)獲得性免疫的機(jī)制
（Van Der Oost J, Westra ER，et al. 2014)
隨著CRISPR-Cas機(jī)理的逐步揭示和新的Cas酶（Cas12/Cas13/Cas14）的發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)這個(gè)系統(tǒng)非常強(qiáng)大，可以精準(zhǔn)高效地實(shí)現(xiàn)基因編輯，比如對某個(gè)基因的敲除、插入和替換等。而CRISPR系統(tǒng)的序列特異性識(shí)別能力已經(jīng)被應(yīng)用在越來越多的領(lǐng)域，如醫(yī)藥，食品，農(nóng)業(yè)和工業(yè)生物技術(shù)等，這些應(yīng)用很大程度上都是以Cas9為基礎(chǔ)進(jìn)行開發(fā)的，而新發(fā)現(xiàn)的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9，使得CRISPR系統(tǒng)在病原體的快速診斷和腫瘤基因檢測領(lǐng)域的應(yīng)用成為可能。
Cas12a-單鏈DNA的“新魔剪”
今年4月，有CRISPR女神之稱的Jennifer Doudna 教授在《Science》撰文指出Cas12酶家族在gRNA的引導(dǎo)下與目標(biāo)序列結(jié)合以后，便會(huì)切換為激活狀態(tài)，瘋狂的切割體系內(nèi)其它的單鏈DNA。Cas12a這一特點(diǎn)可被用于分子診斷領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)對腫瘤基因或特定病原體的檢測。在體系內(nèi)加入含有報(bào)告基團(tuán)的單鏈底物后，如果Cas12a識(shí)別到靶序列（目標(biāo)病原體或腫瘤基因）的存在，就會(huì)切割單鏈底物從而釋放熒光報(bào)告基團(tuán)。
Cas12a具有靶向切割單鏈DNA活性及附帶切割特點(diǎn)
(Chen JS, Ma E, et al. 2018)
Cas12a可以實(shí)現(xiàn)HPV的準(zhǔn)確分型
但是如果樣本中的目標(biāo)基因含量非常少，Cas12a與gRNA復(fù)合物匹配到需檢測靶序列的概率很低。此時(shí)就需要先擴(kuò)增靶序列，提高需要檢測底物的豐度。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是常用于這一目的擴(kuò)增手段，但是需要專門的PCR儀進(jìn)行溫控反應(yīng)。而另外一種信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)——重組聚合酶擴(kuò)增（RPA），可以在恒溫狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)信號(hào)的擴(kuò)增，而不需要復(fù)雜的升溫降溫過程。Doudna教授創(chuàng)新性的將Cas12a靶向切割單鏈DNA的特性與RPA技術(shù)聯(lián)合起來，開發(fā)了一種名為DETECTR的技術(shù)（DNA Endonuclease-Targeted Crispr Trans Reporter）。研究結(jié)果表明，肛拭子取樣后等溫?cái)U(kuò)增10分鐘，使用Cas12a系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可以在1小時(shí)內(nèi)檢測到人乳頭瘤病毒（HPV）并準(zhǔn)確區(qū)分兩種相似的亞型，HPV16和HPV18。DETECTR技術(shù)的開發(fā)為實(shí)現(xiàn)病原體或腫瘤基因的即時(shí)檢驗(yàn)（POCT） 又提供了一個(gè)強(qiáng)有力的支撐平臺(tái)。
研究者基于CRISPR-Cas12a聯(lián)合 RPA技術(shù)開發(fā)的
DETECTR技術(shù)(Chen JS, Ma E, et al. 2018)
那CRISPR-Cas12a與CRISPR-Cas9有什么區(qū)別呢？ Cas9是最早發(fā)現(xiàn)的Cas酶之一，也是目前為止研究最深入和應(yīng)用最廣泛的Cas酶，在基因編輯、疾病治療等方面的應(yīng)用前景巨大。然而CRISPR-Cas9缺乏切割單鏈核酸的酶活結(jié)構(gòu)域，無法用于體外檢測。而Cas12/13/14則普遍存在第二個(gè)酶活結(jié)構(gòu)域，當(dāng)?shù)鞍渍_結(jié)合到靶向序列時(shí)，能夠激活這一結(jié)構(gòu)域，切割探針小分子，實(shí)現(xiàn)從待檢序列信息到熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)化。基于它們的這一特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域需要靶向檢測已知序列的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)普通實(shí)時(shí)定量PCR所無法達(dá)到的靈敏度，擺脫對實(shí)時(shí)定量PCR儀的依賴。