為便于研究長(zhǎng)期發(fā)熱癥狀，Petersdorf[1]在1961年通過對(duì)100例患者前瞻性觀察，首次提出不明原因發(fā)熱(fever of unknownorigin，F(xiàn)UO)的概念。隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，不明原因發(fā)熱的概念也在不斷擴(kuò)展，目前感染性疾病是FUO的最主要原因[2]，在20世紀(jì)90年代，20%～60%的FUO病屬于感染性疾病[3]。而進(jìn)入21世紀(jì)后的10年內(nèi)，最主要的感染病原為細(xì)菌、病毒以及真菌和寄生蟲。近年來病毒感染比例呈明顯上升趨勢(shì)。然而傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法需要病原基因組序列的先驗(yàn)知識(shí)，因此對(duì)于樣本中的未知病原需要有新的序列非依賴性的檢測(cè)手段來處理。
近些年來，隨著二代測(cè)序技術(shù)(NGS)的飛速發(fā)展，得益于二代測(cè)序通量的高速提升和成本的大幅下降，使得二代測(cè)序技術(shù)越來越廣泛的應(yīng)用于宏基因組檢測(cè)未知病原的研究領(lǐng)域中。相對(duì)于傳統(tǒng)的序列依賴性的核酸檢測(cè)技術(shù)，如PCR技術(shù)等，二代測(cè)序結(jié)合宏基因組技術(shù)具有不依賴于病原序列信息的特性，因此對(duì)臨床樣本的檢測(cè)使得我們能夠得到更加廣泛的病毒譜，進(jìn)而也可以發(fā)現(xiàn)一些用傳統(tǒng)方法無法觀察到的病原組成情況[4]。
本研究中，對(duì)10份不明原因發(fā)熱癥狀的血液樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序(metagenomics shotgun sequencing, MSS)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了大量的人細(xì)環(huán)病毒(torque teno Virus，TTV)相關(guān)序列。對(duì)這些序列進(jìn)行組裝拼接并分析其進(jìn)化樹后，發(fā)現(xiàn)其分屬于α TTV、β TTV和γ TTV三個(gè)屬。
壹
材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
選取10份漢坦病毒IgG抗體檢測(cè)(ELISA)陰性的不明原因發(fā)熱的臨床血液樣本(均為出現(xiàn)發(fā)熱癥狀后一至兩周內(nèi)采集)，采用Qiagen公司的RNease Mini Plus Kit試劑盒進(jìn)行核酸提取。病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen公司的Superscript Ⅲ試劑盒進(jìn)行一鏈合成，隨后加入Klenow片段37 ℃孵育2 h進(jìn)行二鏈合成。反轉(zhuǎn)后的cDNA采用REPLI-g WTA Single Cell Kit(Qiagen)試劑盒進(jìn)行基于多重鏈置換反應(yīng)(multiple displacement amplification，MDA)的預(yù)富集。采用Thermalfisher公司的Ion Torrent Hi-Q試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫。以上步驟均按照相關(guān)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。測(cè)序反應(yīng)在Ion Torrent PGM(Thermalfisher)平臺(tái)上完成。
1.2 數(shù)據(jù)分析
所有原始數(shù)據(jù)均為從Ion Torrent平臺(tái)下載的bam格式下機(jī)數(shù)據(jù)，應(yīng)用本地分析軟件Virus IdentificationPipeline(VIP)進(jìn)行分析[5]。
貳
結(jié)果
2.1 測(cè)序結(jié)果
在10份樣本中均發(fā)現(xiàn)了不同程度的TTV感染，其中2號(hào)和6號(hào)樣本為單一性的α TTV感染；1號(hào)、5號(hào)和9號(hào)樣本為α TTV和γ TTV共感染；7號(hào)樣本為α TTV和β TTV共感染；3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)和10號(hào)樣本為α TTV、β TTV和γ TTV共感染。α TTV、β TTV和γ TTV的感染率分別為100%、50%和70%(表1)。在這10份樣本中，α TTV、β TTV和γ TTV3種TTV基因組覆蓋度達(dá)到70%以上的概率分別為：60%、30%和40%(表1)。其中8號(hào)樣本病毒載量最高，α TTV、β TTV和γ TTV3種TTV基因組覆蓋度均達(dá)到99%以上，αTTV和γTTV的平均測(cè)序深度達(dá)到了400×以上(表1)。所有匹配讀長(zhǎng)(Reads hit)在整個(gè)病毒基因組上的位置如圖1所示。
圖1 8號(hào)樣本中三種TTV(A：TTV, B：TTMV, C：TTMDV)一致性序列的進(jìn)化分析(紅色圓點(diǎn)代表組裝出的一致性序列，藍(lán)色方塊代表親緣關(guān)系最近的代表株)
Fig.1 Phylogenetic analysis of TTV in 3 genera (A: TTV, B:TTMV, C：TTMDV) in sample 8 (red dotrepresent the assembled consensus sequence, blue square represent the closestreference)
表1 α TTV、β TTV和γ TTV在10份血液樣本中的測(cè)序數(shù)據(jù)
Tab.1 Sequencing data ofα TTV, β TTV and γ TTV in 10 serum sample
2.2 進(jìn)化分析
用10份樣本中的測(cè)序reads組裝出的置信序列與從GenBank引用的TTV各型別的代表株以NJ法構(gòu)建序列進(jìn)化發(fā)生樹。其中8號(hào)樣本的三種TTV序列進(jìn)化樹分別見圖1。
叁
討論
不明原因發(fā)熱(FUO)是常見的臨床綜合征，病因廣泛，有報(bào)道超過200種疾病能夠引起FUO。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在1952－1994年間的FUO病例中，感染性疾病(占比28%)為主要病因，非感染性炎癥占比21%，惡性腫瘤占比17%，病因不明占比19%[2]。在非細(xì)菌感染樣本中，病毒感染呈明顯上升趨勢(shì)。但在無先驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的情況下，傳統(tǒng)免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)手段難以對(duì)樣本中的未知病毒病原進(jìn)行鑒定。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新的病毒病原被發(fā)現(xiàn)。而這些新發(fā)現(xiàn)的病毒飛速的革新著我們關(guān)于病毒復(fù)雜程度的認(rèn)知。越來越多的證據(jù)表明，這些新發(fā)現(xiàn)的病毒比傳統(tǒng)已知的病毒病原在臨床樣本中分布更為普遍。傳統(tǒng)意義上的病毒組(virome)的概念現(xiàn)在看來僅僅是構(gòu)成人體宿主宏微生物組的一部分[6]。盡管腸道微生物組的研究是當(dāng)今的熱門，但是血液病毒組對(duì)于宿主免疫反應(yīng)和器官移植的安全依然有著極其重要的指示功能[7][8]。
近些年來，關(guān)于環(huán)狀、復(fù)制起始蛋白編碼的單鏈DNA病毒[circular，replication initiatorprotein(Rep)encoding，single-strand DNA virus，CRESS-DNA virus]的報(bào)道越來越多。這些病毒曾經(jīng)被認(rèn)為只能感染植物或動(dòng)物，但近10年的研究發(fā)現(xiàn)，該類病毒具有十分寬廣的宿主范圍，包括人在內(nèi)的脊椎動(dòng)物到無脊椎動(dòng)物均包含在內(nèi)[9]。這類病毒包括：Anellovirus；Circovirus；Cyclovirus；Gemycircularvirus；Gyrovirus；Smacovirus等[10,11,12,13]。這些病毒的病原學(xué)特性依然不清楚。而有報(bào)道稱Anellovirus能占到整個(gè)病毒組的70%左右[14]。在本研究中，核酸提取雖然采用的是RNA提取試劑盒，但也能夠采集到足量的病毒DNA，滿足檢測(cè)的需求。在本研究及類似的研究中[15]，作為DNA病毒的TTV的核酸均由RNA提取試劑盒所提取。
人細(xì)環(huán)病毒(torque teno virus，TTV)最早于1997年在日本一例輸血后發(fā)生急性感染的非甲-戊型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)[16]，被懷疑與肝炎相關(guān)。隨后TTMV(Torque teno mini virus，)與TTMDV(Torque teno midi virus)分別于2000年和2007年[17]相繼被發(fā)現(xiàn)。隨后的研究表明，人TTV在世界范圍內(nèi)存在廣泛的分布[18,19]。國際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將TTV歸類于一個(gè)新建立的科：指環(huán)病毒科(Anelloviridae)，目前該病毒科共包含9個(gè)病毒屬：α TTV(Alpha torquevirus)、β TTV(Betatorquevirus)、γ TTV(Gamma torquevirus)、δ TTV(Delta torquevirus)、ε TTV(Epsilontorquevirus)、η TTV(Eta torquevirus)、ι TTV(Iota torquevirus)、θ TTV(Thetatorquevirus)、ζ TTV(Zeta torquevirus)。目前國際病毒分類委員會(huì)主要以O(shè)RF1基因?yàn)榛A(chǔ)對(duì)TTV進(jìn)行分類。以堿基序列35%的一致性為閾值來劃分以人為宿主的3個(gè)屬：Alphatorquevirus genus(Torque teno virus，TTV)，Betatorquevirus genus(Torque tenomini virus，TTMV)和Gammatorquevirus genus(Torqueteno midi virus，TTMDV)[15]。除此之外還有其他以各種動(dòng)物為宿主的屬：豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno sus virus, TTsuV)，貓細(xì)環(huán)病毒(Torqueteno felis virus)，狗細(xì)環(huán)病毒(Torque teno canis virus)以及樹鼬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno tupaia virus)[20]，近些年來，在嚙齒類以及蝙蝠中也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的TTV。到目前為止，TTV被認(rèn)為分為5個(gè)主要的進(jìn)化簇，包含數(shù)10株準(zhǔn)種。各準(zhǔn)種間在ORF1上的堿基序列的差異超過35%[21]。在本研究中，二代測(cè)序產(chǎn)生的讀長(zhǎng)在α TTV、β TTV和γ TTV3個(gè)屬中均有分布。其中α TTV感染率最高，在10份樣本中均有檢出，γ TTV和β TTV排在其后，分別在7份和5份樣本中檢出。全部樣本中未發(fā)現(xiàn)其他屬TTV相關(guān)的測(cè)序讀長(zhǎng)。而全部的10份樣本中，除1號(hào)樣本外，其余9份樣本的α TTV檢出水平高于β TTV和γTTV。在β TTV和γ TTV之間，除了2號(hào)和6號(hào)樣本兩者均未檢出，7號(hào)樣本β TTV檢出高于γ TTV以外，其余7份樣本中γ TTV檢出均高于β TTV。
TTV基因組為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，無包膜?；蚪M大小從2.86 ～2.91 kb(TTMV)、3.24～2.35 kb(TTMDV)到3.6～3.9kb(TTV)不等，包含4個(gè)開放閱讀框(openreading frame，ORF)，約2.6 kb，以及一個(gè)非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)，約1.2 kb。不同TTV分離株之間編碼蛋白的氨基酸差異可以高達(dá)47%～70%[19,22]。這種差異性分布并不均一，在編碼區(qū)明顯多于非編碼區(qū)。
對(duì)于TTV基因組如此高變的解釋是TTV擁有非常快的突變速率[22]，但有趣的是，作為一個(gè)DNA病毒、在缺乏自我復(fù)制機(jī)制、必須利用宿主具有高校準(zhǔn)能力的DNA聚合酶系的情況下，依然擁有如此高的突變速率。合理的解釋是由于其單鏈的基因組結(jié)構(gòu)和編碼復(fù)制過程中涉及的蛋白的能力所致[23]。另一種解釋是僅有小部分TTV擁有完整的感染宿主細(xì)胞的原件，而大多數(shù)情況下感染宿主細(xì)胞是1個(gè)多準(zhǔn)種的協(xié)同過程。也有報(bào)告稱Epstein-Barr virus(EBV)在TTV的感染過程中起到了協(xié)助的作用[24]。
TTV在世界范圍內(nèi)廣泛存在，但分布并不均一，報(bào)道過的在人群中的分布最低到5%[18]，最高達(dá)到90%[25]。與第一次被發(fā)現(xiàn)相似，TTV普遍存在于各類血液疾病、器官移植、腫瘤甚至牙周炎患者的體內(nèi)。在健康人群中同樣存在廣泛的分布[25]，并且這種分布隨年齡的增加而提高[26]。
TTV具有作為免疫標(biāo)志物的巨大潛力，其廣泛的分布意味著TTV已經(jīng)建立起與宿主之間成功的互作關(guān)系。在一些采用PCR方法對(duì)TTV的病毒血癥進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控的研究中[27]，即便TTV陰性患者在免疫抑制狀態(tài)下也會(huì)變?yōu)殛栃浴Ｌ崾静《驹诮M織中比在外周血中有更高的免疫耐受。Kincaid等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，一種由TTV編碼的miRNA所介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制，加上TTV在正常人群中的廣泛而均一的分布，使得TTV成為了一種免疫低下或免疫缺陷的標(biāo)記。這種miRNA靶向作用于N-myc (and STAT)的反應(yīng)原件(N-myc interactor，NMI)，由此產(chǎn)生對(duì)干擾素的干擾作用，并促使細(xì)胞增殖裂解。
由于缺乏合適的細(xì)胞系，TTV難于進(jìn)行體外培養(yǎng)。同時(shí)缺乏相關(guān)的血清學(xué)方法來驗(yàn)證病毒代謝產(chǎn)物與特異性的抗病毒免疫反應(yīng)。而TTV本身基因組高度的變異以及與宿主相互作用的復(fù)雜性，都使得TTV潛在的病原特性難以評(píng)估。因此，迄今為止尚未有明確的研究證據(jù)證明人細(xì)環(huán)病毒與任何臨床癥狀具有直接的關(guān)系。在本研究中，未檢測(cè)到明確致病病原可能由以下原因?qū)е粒阂皇窃谠絹碓蕉嗟膱?bào)道中所高度懷疑的TTV潛在的病原特性[15]；二是由于10份血液樣本均為出現(xiàn)發(fā)熱癥狀7～14d內(nèi)所采集，而真正的致病病原的基因組序列信息有可能因?yàn)樗拗饕烟幱诜羌毙云诙科?，?dǎo)至在宿主血液中已經(jīng)難以檢測(cè)到，推測(cè)宿主免疫系統(tǒng)對(duì)發(fā)熱致病病原產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)和免疫應(yīng)答后，宿主免疫水平進(jìn)入相對(duì)的受抑制或低下狀態(tài)。而在采樣時(shí)，宿主可能依然處于免疫受抑制或免疫水平低下狀態(tài)，從而導(dǎo)至TTV在血液中的檢出率升高。雖然TTV的病原學(xué)特性并不明確，這種現(xiàn)象提示TTV、宿主與致病病原三者間存在一定的相關(guān)性。另外，考慮到患者并未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤或非感染性炎癥等癥狀，那么其他不明病因?qū)е恋陌l(fā)熱，以及由此而來的宿主免疫水平的下降，則可能導(dǎo)至潛伏的TTV在血液中的檢出率升高。
選自中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2018,32(2)