摘?要?目的：建立一種血清CA125的臨床檢測方法。
方法：一株CA125單抗用于固相包被，另一株與辣根過氧化物酶偶聯(lián)制備CA125的酶標(biāo)記物，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，采用一步法，建立了CA125的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)。
結(jié)果：靈敏度為2.00 U/ml。批內(nèi)CV值低于5.32% (n=22)，批間CV值低于7.39% (n=26)。測得回收率均值為100.9%，60例正常人血清的均值為9.20 U/ml，應(yīng)用本法與IRMA方法同時測定33例病人血樣，兩者相關(guān)方程為Y=0.825X-10.39,相關(guān)系數(shù)r=0.960 0。
結(jié)論： 該方法具有簡便、快速和準(zhǔn)確的特點，未見“HOOK”效應(yīng)的影響，適于臨床檢測和科研應(yīng)用。
??中國圖書分類號?R446.61Measurement of CA125 in serum by an enzyme-linked immunosorbent assay
HUANG Wen-Lin , WANG Wen, WANG Xiao-Jing et al.
??Department of Isotope, China Institute of Atomic Energy,Beijing102413
??Abstract?Objective:To develop a clinical method to measure ovarian cancer marker CA125 in serum.
Methods：The one-step assay is based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). One monoclonal antibody is employed for coating, another for labeling with horseradish peroxidase.
Results：The minimum detectable dose is 2.00 U/ml and analytical recovery of CA125 is 91.1% to 107.4%. The between-runs CVs and the within-runs CVs of 3 samples are lower than 7.39% and 5.32% respectively. The average concentration of CA125 in sera from 60 healthy women is 9.20 U/ml. The correlation of results with CA125 IRMA is 0.960 0.
Conclusion：The assay is a rapid, sensitive and precise method and simple to perform. It is suitable for clinical and research application.
??Key words?CA125?ELISA?Ovarian cancer??卵巢癌是惡性度極高的婦科癌癥。大多數(shù)卵巢癌均發(fā)現(xiàn)于晚期，其生存率較低。卵巢癌在早期被檢測出來能大大降低死亡率，延長患者的生存時間，所以早期的診斷意義重大。卵巢癌早期診斷的一種有效的方法是測定能靈敏反映卵巢癌病變的腫瘤相關(guān)抗原。CA125是與上皮型卵巢癌相伴隨的表面抗原，它用于診斷卵巢癌的靈敏度為100%，疾病復(fù)發(fā)檢測的靈敏度為81%。CA125的酶聯(lián)免疫分析的建立對卵巢癌早期診斷及卵巢癌患者的臨床監(jiān)測有著十分重要的意義。
??1?材料與方法
??1.1?主要試劑和儀器?辣根過氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺、尿素過氧化物、Tween-20系Sigma公司的產(chǎn)品,酶標(biāo)板為Nunc公司(丹麥)產(chǎn)品,CA125抗原、包被用和標(biāo)記用CA125單克隆抗體(與AFP、CEA、PAP、PSA、CA199及CA153無交叉反應(yīng))均購于美國WHPM公司, CA125的IRMA商品藥盒為日本Centocor公司生產(chǎn),酶標(biāo)儀及洗板機為奧地利SLT公司的產(chǎn)品。
??1.2?實驗方法
??1.2.1?酶標(biāo)記物的制備?采用高碘酸鈉氧化法制備CA125的酶標(biāo)記物［3］, 經(jīng)0.01 mol/L pH 7.4磷酸緩沖液透析過夜后,加入等量的甘油保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｓ行诳蛇_一年。經(jīng)稀釋實驗,最佳酶標(biāo)記物工作濃度為1:2 000。
??1.2.2?CA125單抗的包被?將200 μl含CA125包被單抗的pH 9.6碳酸緩沖液(2 μg/ml)加至聚苯乙烯板上,4℃冰箱內(nèi)放置過夜,然后加入含3%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液中，于37℃封閉2.0 h后,酶標(biāo)板可用于免疫反應(yīng)。
??1.2.3?標(biāo)準(zhǔn)的配制?將CA125抗原溶于經(jīng)滅活的新生小牛血清中,配制成含10.00、30.00、80.00、200.00、540.00 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)。用日本Centocor公司的CA125 IRMA 藥盒校正標(biāo)準(zhǔn)值。
??1.2.4?底物溶液和中止劑?將四甲基聯(lián)苯胺100 mg、尿素過氧化氫13 mg溶于1 000 ml pH 5.0磷酸-檸檬酸緩沖液中，即為底物溶液,中止劑為2 mol/L H2SO4。
??1.2.5?酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)?采用一步法加樣程序。50 μl待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)和150 μl酶標(biāo)記物加入包被CA125的酶標(biāo)板中, 37℃溫育3.5 h,棄反應(yīng)液,用0.01 mol/L pH 7.4磷酸緩沖液(含0.05%Tween-20)洗板4次, 加入200 μl底物溶液, 避光顯色30 min,再加入50 μl的2 mol/L H2SO4中止顯色, 于450 nm測定其吸光度OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測血樣CA125的含量。
??2?結(jié)果
??2.1?方法學(xué)的建立
2.1.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度?圖1為典型的CA125酶聯(lián)免疫吸附分析曲線。同時測定20個零標(biāo)準(zhǔn)，求其OD 450均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差，計算出本方法的靈敏度為2.00 U/ml。
2.1.2?精密度?測定3個含有不同濃度的CA125人血清，觀察批間、批內(nèi)變異。結(jié)果見表1。
表1?批內(nèi)與批間變異 Tab.1?Within-run and between-run
| ? | Within-run (n=22) | Between-run (n=26) | |||||
| A | B | C | A | B | C | ? | |
| Average(U/ml) | 27.67 | 75.49 | 199.31 | 25.22 | 80.40 | 186.95 | |
| SD(U/ml) | 1.39 | 4.02 | 9.02 | 1.86 | 3.46 | 13.18 | |
| CV(%) | 5.04 | 5.32 | 4.52 | 7.39 | 4.31 | 6.33 | |
??2.1.4?稀釋試驗?取CA125含量較高的人血清，用小牛血清(零標(biāo)準(zhǔn))進行倍比稀釋。測定結(jié)果見表2。兩樣品的稀釋倍數(shù)與測定值間的相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0。
| ? | 1 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | r |
| Sample 1 (U/ml) | 281.30 | 138.30 | 71.10 | 32.60 | 15.80 | 0.999 9 |
| Sample 2 (U/ml) | 82.10 | 45.70 | 24.60 | 10.20 | 4.00 | 0.996 5 |
? ?2.2?正常參考值范圍的確定?用本法測定了60例健康女性血樣，CA125正常范圍低于30.00 U/ml，均值為9.20 U/ml，與文獻報道(＜35.00 U/ml)一致［4］。
? 2.3?與國外廠商CA125 IRMA藥盒的比較?我們就33例病人血樣與Centocor公司的IRMA法進行了相關(guān)性比較。兩者的相關(guān)方程為Y=0.825X-10.39，相關(guān)系數(shù)r=0.960 0。
??
??3?討論
為了觀察CA125 ELISA一步法是否會產(chǎn)生“HOOK”效應(yīng)，曾配制一系列高濃度CA125樣品進行測定。實驗表明：當(dāng)CA125的濃度高至28 800.00 U/ml時，OD值沒有隨濃度的升高而降低。只是當(dāng)其濃度高至4 000.00 U/ml時，出現(xiàn)測定值的平臺區(qū)。由于少見CA125血清值高于4 000.00 U/ml的病例報道，故一步法的測定結(jié)果不會影響臨床診斷的可靠性。
利用125I標(biāo)記的CA125單抗示蹤實驗表明，在2 μg/ml的單抗?jié)舛劝粫r，聚苯乙烯固相板表面能吸附30%的CA125單抗，補充被吸附的單抗后，包被溶液可重復(fù)利用。單克隆抗體包被量的放射性示蹤實驗，不僅能使我們了解到固相材料對蛋白的吸附能力，同時也使我們在實驗的基礎(chǔ)上去充分利用寶貴的單克隆抗體資源，尤其是那些規(guī)模較大的商品化生產(chǎn)。
??在放射免疫分析中，NaN3作為一種最常用且有效的防腐劑，廣泛地應(yīng)用于標(biāo)記物、抗體和標(biāo)準(zhǔn)的防腐。但在酶免分析中，它卻抑制辣根過氧化物酶的活性而無法用于酶免藥盒。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)了另外一種有機試劑Proclin 300取代NaN3能有效地用于酶免藥盒的防腐而不干擾酶的活性。