摘要：單抗確立了治療用生物制品的領(lǐng)導(dǎo)地位。建立健全的生產(chǎn)平臺是抗體藥物發(fā)現(xiàn)成果無縫轉(zhuǎn)化為臨床和成功上市的關(guān)鍵。一些領(lǐng)導(dǎo)者正在影響單抗生產(chǎn)工藝的設(shè)計。生物類似藥的出現(xiàn)使得降低藥品費用和生物制品的全球化生產(chǎn)成為可能。目前，單抗很容易在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中實現(xiàn)高表達。這些驅(qū)動因素導(dǎo)至了平臺工藝的發(fā)現(xiàn)重大改進。此外，為實現(xiàn)這些需求，生物藥生產(chǎn)工藝也有了一些新趨勢。包括不同表達系統(tǒng)的評價，連續(xù)培養(yǎng)和非層析純化工藝。本文討論了這些驅(qū)動因素在單抗生產(chǎn)工藝中所產(chǎn)生的變化。
1單抗平臺工藝介紹
目前單抗是最成功的一類生物制品。批準(zhǔn)上市的單抗數(shù)量已超過50種，到2020年銷售額有望超過1250億美元。能夠與特定靶點結(jié)合的高度特異性和親和能力，以及目的蛋白序列易于人源化和全人源化的特性導(dǎo)至這類生物制品的爆炸性增長。最近20年該類產(chǎn)品發(fā)展迅猛，目前已有超過300種單抗處于臨床試驗階段。單抗已被批準(zhǔn)廣泛用于惡性腫瘤、免疫學(xué)疾病和罕見病等多個適應(yīng)癥。
除了與目標(biāo)細(xì)胞表面靶點的高度特異性結(jié)合能力之外，快速開發(fā)出強健的生產(chǎn)工藝將單抗候選產(chǎn)品推進臨床試驗階段的能力也成為單抗項目順利推進的關(guān)鍵因素。單抗生產(chǎn)的便捷性和速度使這些候選產(chǎn)品的快速進入臨床試驗，這些工藝的可擴展性和穩(wěn)健性可極大地促進了大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。
蛋白質(zhì)生產(chǎn)工藝的開發(fā)時需要考慮到多個方面，包括雜質(zhì)去除、穩(wěn)健性、可擴展性以及使用易于獲得的大量供應(yīng)的原材料。工藝能力不僅要考慮滿足早期臨床試驗所需的規(guī)模，也要考慮支持長期供應(yīng)的需求和規(guī)模。因此，充分利用平臺方法是開發(fā)生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵。穩(wěn)健性、可擴展性和可重復(fù)性的水平意味著這些生產(chǎn)工藝看起來與用于實驗室純化少量蛋白的工藝存在明顯差異。工藝開發(fā)是一項耗時的工作，需要進行大量的試驗。因此，只要情況允許，工業(yè)界都會傾向于采用平臺方法。
從商業(yè)角度看，平臺方法具有明顯的優(yōu)勢。進入臨床的速度通常是決定公司成敗的關(guān)鍵因素。單抗平臺可以在一年之內(nèi)將項目從基因設(shè)計階段推進到IND階段，這對于通常需要2年時間進行開發(fā)的分子項目來說是一個巨大的進步。減少的試驗也意味著研發(fā)成本的降低。工藝平臺的可預(yù)測性使諸如生產(chǎn)和質(zhì)量控制這樣的組織能夠采用模板化的文檔集，這也減少了在生產(chǎn)和放行檢測上花費的時間和資源。單抗的工藝平臺使得從啟動臨床試驗一直到產(chǎn)品商業(yè)化的全過程生產(chǎn)工藝變得高效和穩(wěn)健。平臺方法的一致性和可預(yù)測性極大地促進了這類產(chǎn)品的發(fā)展。
單抗非常尤其適用于平臺方法的應(yīng)用。采用成熟的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可快速和模板化的方式開發(fā)穩(wěn)定的細(xì)胞系。已有幾個經(jīng)過優(yōu)化的表達載體專用于單抗的生產(chǎn)。也有適用于單抗的穩(wěn)健的流加培養(yǎng)工藝。其中的一些細(xì)胞系和培養(yǎng)工藝已用于大規(guī)模生產(chǎn)，并深入表征了影響這些工藝的操作參數(shù)。細(xì)胞系開發(fā)和上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝非常適合采用模板化的方法。然而，對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，最大的差異是下游純化工藝，應(yīng)根據(jù)蛋白特性和關(guān)鍵雜質(zhì)為每種蛋白質(zhì)設(shè)計個性化的純化工藝。單抗的Fc區(qū)能高度特異性的與蛋白A結(jié)合，后者是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁組成部分。蛋白質(zhì)親和層析法已被廣泛應(yīng)用于單抗生產(chǎn)，層析方法幾乎不需要優(yōu)化即可達到95%以上的純度。蛋白質(zhì)A層析后的主要挑戰(zhàn)是去除殘留的宿主細(xì)胞蛋白，高分子量聚合，DNA以及去除病毒污染的能力。領(lǐng)先的生物制藥公司已經(jīng)開發(fā)了一些用于生產(chǎn)單抗的下游工序平臺。與不能在下游工藝中包含關(guān)聯(lián)步驟的其他蛋白質(zhì)項目相比，從模板中使用通用的起始方法的能力，可以減少相應(yīng)的實驗數(shù)量。
這些下游工藝平臺已經(jīng)成功地使大量的單抗產(chǎn)品進入了臨床和商業(yè)領(lǐng)域。然而，目前仍有一些新興趨勢在繼續(xù)塑造生物制藥行業(yè)。下一節(jié)將就領(lǐng)導(dǎo)者的對單抗生產(chǎn)工藝面貌的改變趨勢進行討論。
許多因素正在推動傳統(tǒng)生物制藥生產(chǎn)的改變，因為藥物的銷售價格是由病人的生命和健康的價值決定的，生產(chǎn)成本不被認(rèn)為是一個重要因素。其結(jié)果是，生產(chǎn)成本成為日益關(guān)注的焦點。此外，具有生產(chǎn)能力的組織正在尋求更有效地利用現(xiàn)有的工廠，以減少對新工廠建設(shè)的需求。在推動工藝創(chuàng)新的背景下，許多因素都被進行檢驗。
生物仿制藥(一般又被成為生物類似藥)的出現(xiàn)是傳統(tǒng)生物制藥方式的關(guān)鍵改變。
盡管由于自身的復(fù)雜性，生物類似藥的價格下降并不像小分子藥物那樣顯著，但生物仿制藥的焦點仍集中在生產(chǎn)成本上。2005年10月30日，歐盟頒布了“生物類似藥品指導(dǎo)原則”。此后，許多大型生物技術(shù)公司和大型制藥公司宣布成立生物仿制制藥公司，其中包括山德士、安進、Biogen(屬于三星)、輝瑞和默克雪蘭諾公司，預(yù)計到2020年生物類似藥的市場規(guī)模將近200億美元。美國FDA在接受生物相似藥的應(yīng)用方面更加謹(jǐn)慎，目前已經(jīng)批準(zhǔn)了兩種產(chǎn)品， Zarxio(Neupogen生物相似藥)和Inflectra (Remicade生物相似藥)。而截止至2016年5月，EMA已經(jīng)批準(zhǔn)了22個生物類似藥。隨著這一趨勢在全球范圍內(nèi)不斷擴大，生物類似藥將顯著降低商品成本(COGS)。
隨著生物類似藥的興起，人們對全球化生物制藥的興趣也越發(fā)濃厚。這也與幾個市場對在生物制藥本土企業(yè)給予優(yōu)惠待遇有關(guān)。中國的情況尤為明顯，輝瑞和通用電氣聯(lián)合推出了一種生物類似藥生產(chǎn)工廠，名為KU Bio。其他生物制藥企業(yè)也進入了包括無錫在內(nèi)的中國市場。2015年12月，中國食品藥品監(jiān)督管理總局(cFDA)宣布，中國將加快藥品上市申請的審批程序。在拉丁美洲和南非，生物類似藥的本土化生產(chǎn)趨勢也開始高漲起來。一系列從事生物藥生產(chǎn)的印度公司數(shù)量也有明顯增長。
一次性生產(chǎn)技術(shù)的增長推動了全球化的生產(chǎn)，這種技術(shù)顯著降低了基礎(chǔ)建設(shè)投資。一次性生產(chǎn)技術(shù)使全程采用用后即棄的方式迅速用于生產(chǎn)臨床樣品成為可能。生物制藥的一次性生產(chǎn)是一種趨勢，現(xiàn)已發(fā)展到商業(yè)制造領(lǐng)域，已有幾家生產(chǎn)廠家先后使用了多個2000L一次性生物反應(yīng)器來生產(chǎn)生物制藥。如安進公司在新加坡的制造工廠利用6×2000L的一次性生物反應(yīng)器來進行細(xì)胞培養(yǎng)。與目前仍處于主導(dǎo)地位的大型不銹鋼設(shè)備相比，這些技術(shù)使生物制藥的cGMP生產(chǎn)更容易實現(xiàn)。結(jié)合可快速組裝的模塊化結(jié)構(gòu)，一次性生產(chǎn)成為一種可以在全世界范圍內(nèi)擴展生物制藥的技術(shù)。
最近幾十年來，細(xì)胞培養(yǎng)的表達量也有顯著提高。如今，經(jīng)14天的批培養(yǎng)后，單抗通?？梢赃_到5 g/L的表達水平。而通過流加生物反應(yīng)器的持續(xù)補料還可以獲得更高的表達量。這些進步是由細(xì)胞系表達載體的開發(fā)、克隆篩選以及細(xì)胞培養(yǎng)基的變化所獲得的。這種產(chǎn)品表達的增加反過來也促使小型生物反應(yīng)器(例如2000L一次性生物反應(yīng)器)能夠用于商業(yè)生產(chǎn)。
上游工藝生產(chǎn)率的提高導(dǎo)至下游工序成為生產(chǎn)瓶頸。盡管有人認(rèn)為目前使用的固定層析工藝能夠滿足數(shù)噸單抗的生產(chǎn)要求，但人們對純化技術(shù)的興趣仍在增加，以期望其顯著提高生產(chǎn)率。近期熱點包括對連續(xù)生物處理(通常用于連續(xù)流加培養(yǎng)和下游操作)，以及可以大規(guī)模使用的非層析技術(shù)。 另一個重新引起關(guān)注的領(lǐng)域是非層析分離方式，在這種分離方式可以完全擺脫對層析柱的依賴。
導(dǎo)至平臺方法進化的另一個主要因素是特定的單抗類似構(gòu)造正被開發(fā)為潛在的治療手段。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)正迅速超越傳統(tǒng)的單抗，涉足包括Fc融合蛋白、雙特異性抗體(bsAbs)和融合蛋白在內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)。這些新構(gòu)造都需要調(diào)整原有的單抗平臺工藝來支持它們的生產(chǎn)。
Fc融合蛋白是通過將單抗的Fc區(qū)域的編碼序列與另一種蛋白質(zhì)的編碼序列連接后表達的。Fc區(qū)域作為融合部位具有幾個優(yōu)勢。許多生物活性肽和蛋白質(zhì)表現(xiàn)出在腎臟的快速清除，血漿半衰期較短。Fc區(qū)域可以與新生的Fc受體結(jié)合，延長抗體的半衰期，同時對融合部分也有同樣作用。已經(jīng)批準(zhǔn)上市7個Fc的融合蛋白，其中至少有兩種(Enbrel和Orencia)每年銷售額超過10億美元，達到重磅炸彈級別。安進公司的單抗原始平臺包括了Fc融合蛋白的純化。然而，對于Fc融合蛋白來說，存在幾個關(guān)鍵的下游差異，包括對蛋白裂解的敏感性和比常規(guī)的單抗更高的高分子量聚集(HMW)水平的可能性。典型的單抗下游平臺方法經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整洗脫條件后通常是可行的，以保證分子的穩(wěn)定性和多聚體的有效清除。
雙特異性抗體(bsAbs)設(shè)計為能夠同時結(jié)合和中和兩種不同抗原(配體、細(xì)胞受體或細(xì)胞因子)或兩種不同靶點的蛋白質(zhì)。由于這一特性，雙特異性抗體可以作為調(diào)節(jié)劑，將免疫效應(yīng)器和細(xì)胞毒性因子，如T細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到腫瘤或感染細(xì)菌內(nèi)部?？贵w的兩個手臂不同，這就導(dǎo)至了雙特異性抗體的生產(chǎn)工藝的幾個挑戰(zhàn)。例如，如果抗體的兩個單元分別表達，下游工藝需要拆分為兩個半部分，然后重新組裝以形成一個異質(zhì)二聚物。除非采用重組工藝，即使采取抑制同二聚物的形成(通過使用一種孔-穴方法或類似的技術(shù)以促進異質(zhì)二聚物的形成)，仍會形成少量的同源二聚物，需要在下游處理工藝中移除。因此，這種雙特異性抗體的構(gòu)造需要一個更復(fù)雜的下游工藝。
然而，使用一個普通的輕鏈和孔眼技術(shù)(KiH)可以使在細(xì)胞培養(yǎng)表達雙特異性抗體。由于KiH的構(gòu)造，使均質(zhì)聚物的形成受到抑制。如果所選的序列具有生物化學(xué)的差異，那么形成的少量的同源二聚物就可以被移除。即使在沒有共同的輕鏈的情況下，也可以做到這一點。例如，來源于Xencor的X單抗技術(shù)中，同質(zhì)二聚物和異質(zhì)二聚物在其設(shè)計的Fc區(qū)域中有微小的差異，使它們能夠在CEX中分離。該工程改造的另一個目的是提高雙特異性抗體的功能效應(yīng)。
抗體偶聯(lián)藥物(ADC)是一種抗體與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的一種藥物，其主要用于癌癥治療。ADCs下游工序的末端，化學(xué)接合步驟除外，其余下游工藝與傳統(tǒng)的單抗相同。而這通常需采用超濾/過濾工藝移除未偶聯(lián)的小分子。與單抗的主要區(qū)別在于，由于連接分子的毒性，需要更嚴(yán)格的控制和人員保護。
其他的下一代單抗結(jié)構(gòu)包括在C或N端上對抗體進行融合，以進一步增強同時結(jié)合多個靶點的能力。如與抗體結(jié)構(gòu)融合的抗溶蛋白。如圖1所示，包括工程scFvs、雙抗和三抗，以及以二聚物或三聚物的形式組成的Fab偶合體。如果這些治療模式成為一種治療模式，將會導(dǎo)至平臺工藝方法的發(fā)展。
圖1 下一代抗體的可能結(jié)構(gòu)
3單抗上下游工藝的現(xiàn)狀和進展
3.1 單抗平臺發(fā)展驅(qū)動
本節(jié)概述了幾家大型生物制藥公司開發(fā)并成功地用于大規(guī)模生產(chǎn)單抗生產(chǎn)的下游工序。在這些工藝流程中幾個方面是通用的。在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，單抗被分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。收獲和復(fù)蘇規(guī)程通常采用離心法，然后是深層過濾和一系列的膜過濾器。如果規(guī)模較小，可以使用離心分離法，使用一系列的深層過濾器，這些過濾器通?？梢灾貜?fù)使用。平臺工藝幾乎都是蛋白質(zhì)A的親和層析。在某些情況下，可以在蛋白質(zhì)A層析中增加選擇性洗脫方式，從而進一步增強宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的清除能力。非蛋白A的方案已經(jīng)被開發(fā)出來并用于某些治療蛋白質(zhì)商業(yè)生產(chǎn)，但由于缺乏通用的方法和處理過程的穩(wěn)健性，所以尚未普遍應(yīng)用。按照WHO指導(dǎo)原則，工藝應(yīng)包含兩個不同原理的病毒清除工序。低pH病毒活性和納濾廣泛應(yīng)用于單抗生產(chǎn)。低pH經(jīng)典方法是蛋白從蛋白質(zhì)A層析洗脫后，立即置換低pH值的緩沖液中。蛋白A親和層析和病毒滅活后，采用一種或兩種精制層析法來清除高分子量聚合體、宿主細(xì)胞蛋白、DNA，并清除潛在的病毒。各平臺方法的主要區(qū)別在于不同原理精制層析步驟的順序。鑒于目前在工業(yè)中日益普遍的高表達細(xì)胞培養(yǎng)過程(5-10g/L)，要求精制層析工藝上有很高的柱載量。
每個公司最終都會根據(jù)自己的表達系統(tǒng)和細(xì)胞培養(yǎng)過程以及他們在研發(fā)中主要使用的單抗類型和子類來定制單抗下游平臺的方法。主要的標(biāo)準(zhǔn)是，平臺方法需要在不經(jīng)過顯著修改的情況下，在廣泛的IgG分子中保持健壯和適用。另一個關(guān)鍵的標(biāo)準(zhǔn)是，平臺能夠適應(yīng)生產(chǎn)進度，并盡可能減少在下游處理過程中所花費的時間。因此，另一個關(guān)鍵的驅(qū)動因素是各個精制工藝的載量。
3.2 單抗下游平臺現(xiàn)狀
安進公司是率先披露其下游工藝平臺的公司之一。完全模板化的方法被證明是不可行的，但是進行少量的開發(fā)實驗即可得到符合要求的工藝參數(shù)。這些工藝參數(shù)的例子包括：蛋白質(zhì)的洗脫pH值和洗脫層析步驟的選擇，這取決于需要清除的雜質(zhì)的主要成分。圖2顯示了當(dāng)時在安進公司中使用的下游平臺方案。典型的精制工藝通常采用先陽離子交換層析(CEX)吸附模式，再根據(jù)需要采用疏水層析(HIC)的流穿模式去除高聚物，或采用陰離子交換層析(AEX)去除HCP。在少數(shù)情況下，會使用羥磷灰石以去除特定的與產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。經(jīng)過第一步精制CEX工序使HCP和HMW達到要求后，采用了AEX膜層析作為第二步病毒滅活工藝。
基因泰克公司另一家率先利用平臺方法開發(fā)了一種單抗工藝的公司。基因泰克歷史上使用CEX和AEX層析法作為其下游平臺的一部分(圖3)，這一趨勢最初是利用CEX的結(jié)合與洗脫模式作為第一個精制步驟，然后AEX流穿模式。一般單抗的pI顯堿性，因此容易與CEX填料緊密結(jié)合，也容易在AEX填料中流穿。CEX步驟清除了HMW和HCP。然而，AEX的步驟是需要低電導(dǎo)率才能成功地去除HCP。AEX上樣前需要大體積的儲罐負(fù)荷這可能會導(dǎo)至在操作過程中出現(xiàn)瓶頸。使用混合模式的Captoadhere填料代替?zhèn)鹘y(tǒng)的AEX填料，有助于減少高倍稀釋的需要。
使用AEX的一個主要缺點是只能清除HCPs而不能清除HMW聚合物?？梢栽趦?yōu)化AEX工藝，采用弱分離模式可以減小這個缺陷，只是這種情況下會有一部分產(chǎn)品保留在填料上。在這種操作模式下，AEX工藝在去除HCP的同時還可去除部分HMW。我們從結(jié)構(gòu)上推測，在電導(dǎo)率非常低條件，填料骨架的某些疏水性部分相互作用能去除部分HMW。
圖2 安進公司的單抗下游工藝平臺方法
上述兩種方案都有一個缺點，即要求對AEX步驟進行大量稀釋。此外，CEX和AEX通常無法達到足夠的HMW清除效果。
不同單抗HMW水平不一致，但經(jīng)蛋白質(zhì)A層析后的HMW的濃度一般不超過5%。這樣的水平常常需要像前面提到的那樣，采用HIC工藝。另一種創(chuàng)新方法是在不加鹽的條件下，高上樣量(200g/L)下進行HIC工藝操作。
這種方法需要使用一種高度疏水性的HIC填料，而不需要增加額外的高滲性鹽。調(diào)節(jié)上樣前的pH值，以在這種高度過載條件清除HMW。使用這種超高容量的步驟，可以處理大量的單抗，并作為Biogen(圖4)的單抗平臺的一部分，與AEX流穿模式一起使用。超高上樣量精制工藝能力使層析循環(huán)數(shù)減少，也減少了批生產(chǎn)的上樣時間。
圖3 基因泰克單抗下游工藝平臺
Millipore-Sigma討論過一種幾乎完全采用流穿模式精制的方案。在這種建議中，CEX采用高度過載模式上樣。這樣操作時，CEX有一定能力清除HCP。我們同樣推測，這是由于與層析填料的疏水相互作用造成的。該精制工藝最后以AEX流穿模式完成整個工藝。
圖4 Biogen公司單抗下游工藝平臺
合同開發(fā)和制造(CMDO)需要將許多不同的細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)過程融入到下游平臺方法中。因為需要同時去除HCP和HMW，這對下游平臺方案來說是個重大挑戰(zhàn)。對下游單抗平臺的各種需求如圖5所示。不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)基種類存在很多的可變性，這些都下游工藝平臺進行處理。因此，兩步精制工藝都需要可以同時清除HMW和HCP。
圖5 確定KBI生物制藥平臺方法所考慮的因素范圍
3.3廣泛應(yīng)用的單抗下游平臺
CEX和AEX的傳統(tǒng)工藝不能完全滿足這需求。實現(xiàn)該目標(biāo)的一個關(guān)鍵修改是使用混合模式層析作為單抗下游平臺的一部分?；旌夏Ｊ綄游鍪菍⑹杷鶊F加入AEX或CEX的骨架結(jié)構(gòu)中。層析填料的疏水性增強，使其在CEX和AEX模式上都得到了改善了去除多聚體的能力，更適合于單抗工藝。此外，這兩種層析方式還可同時去除HCP和DNA。不同單抗的親水性不同。因此KBI公司的平下游臺工藝被定義為陰離子交換層析（如Q葡聚糖FF或Capto Q或Fractogel SO3等疏水性填料到Captoadhere或Nuvia cPrime的混合模式填料）。這種對疏水性的調(diào)整可以為每一個單抗量身定做最佳的條件。同樣的，取決于所選的填料種類，CEX的結(jié)合和洗脫工藝也會略微或者中等程度調(diào)整疏水性。盡管該方法需要一定程度的實驗工作，如果適用于某個單抗，首選方法使用包含AEX和CEX的混合模式層析，這樣可以使用較少的疏水性固定相的用量。如圖6所示的該流程在KBI公司中包括單抗結(jié)構(gòu)、細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)工藝的等方面得到廣泛應(yīng)用。
圖7顯示了，通過這個平臺工藝進行了大量的單抗HMW聚合物和HCPs的清除圖譜文件。從圖中可以看出，采用該平臺后，HMW的總水平小于1%， HCP低于50 ppm。特別是對于KBI公司這樣的CMDO來說，能夠廣泛覆蓋的不同結(jié)構(gòu)單抗的能力是平臺的關(guān)鍵。
圖6 KBI生物制藥公司為FIH manufacturing采用的單抗下游工藝
圖7 KBI生物harma平臺DSP方法的性能。(a)HMW結(jié)果，(b)HCP結(jié)果
4可能對單抗生產(chǎn)產(chǎn)生影響的新興工藝技術(shù)
各種下游平臺工藝可以滿足最先進的細(xì)胞批培養(yǎng)的單抗生產(chǎn)工藝處理需要。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)工藝的生產(chǎn)力的提高要求研發(fā)替代方法，以提高下游的生產(chǎn)效率。由于希望更充分地利用現(xiàn)有的生產(chǎn)設(shè)施，并希望減少生物藥的生產(chǎn)成本，這些技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域引起了極大的興趣。最終目標(biāo)是將生產(chǎn)的生物仿制藥的成本降低到每克10美元。
4.1 連續(xù)生產(chǎn)
小分子藥物通常采用連續(xù)生產(chǎn)方法，以最大限度地提高生產(chǎn)設(shè)備的生產(chǎn)效率。然而，而傳統(tǒng)的生物制藥生產(chǎn)只能采用離散的批生產(chǎn)方式，包括上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝和下游的層析工藝。在這方面，人們對實現(xiàn)生物制藥生產(chǎn)的持續(xù)加工的價值越來越感興趣。流加細(xì)胞培養(yǎng)工藝是將新鮮培養(yǎng)基添加到原有培養(yǎng)基中，并不斷提取含有產(chǎn)品的培養(yǎng)基，其主要用于不穩(wěn)定或表達量低的產(chǎn)品。傳統(tǒng)的流加培養(yǎng)工藝僅用于培養(yǎng)不能在批培養(yǎng)中達到高水平的被抑制表達或不穩(wěn)定的產(chǎn)品。然而，出于生產(chǎn)效率的考慮而不是與產(chǎn)品本身有關(guān)，近期流加培養(yǎng)工藝正變得越來越普遍。因為不需要等待細(xì)胞低的接種量中擴增的時間，而是通過一個連續(xù)的連續(xù)介質(zhì)來維持在高細(xì)胞密度的生產(chǎn)階段，流加培養(yǎng)工藝可明顯提高生物反應(yīng)器的生產(chǎn)率。需要大量的細(xì)胞培養(yǎng)基的缺點可在后勤上適當(dāng)解決，這套系統(tǒng)證明花費更高的費用獲得更高的生產(chǎn)力合算的。此外，細(xì)胞分離技術(shù)的改進(如Repligen公司的切向流分離技術(shù))也促進了的流加細(xì)胞培養(yǎng)的廣泛應(yīng)用。
在連續(xù)流加培養(yǎng)中，產(chǎn)品的純化可以通過分批層析系統(tǒng)的多個循環(huán)來處理，這也引起了對連續(xù)的上游和下游工序的重新興趣。傳統(tǒng)的層析是一個批處理過程。步驟從層析柱的衛(wèi)生處理，平衡，和裝載到洗滌，洗脫，脫柱和柱再生，和儲存。批處理工藝的通量和生產(chǎn)率是有限的。首先，由于流動分布的限制，層析柱的最大直徑只能達到2米。因壓力降的限制，填料床高度最高只能裝30厘米 (通常是20厘米)。這從根本上限制了單個循環(huán)處理產(chǎn)品的數(shù)量。當(dāng)需要多個循環(huán)時，中間產(chǎn)品需要保存較長的時間。中間樣品儲存步驟也需要采用大體積的儲罐，這是對生產(chǎn)率的另一個限制。連續(xù)的層析分離可以把這個批處理工藝變成連續(xù)的或半連續(xù)的工藝，如圖8所示。結(jié)合一個持續(xù)的上游流加培養(yǎng)工藝，可以改變目前生物制藥生產(chǎn)工藝的設(shè)計模式。最近對連續(xù)生產(chǎn)工藝的經(jīng)濟分析表明，連續(xù)生產(chǎn)工藝可以與傳統(tǒng)的批量生產(chǎn)工藝相比，采用一個大幅減小的生物反應(yīng)器的生產(chǎn)成本基本相同。這可以顯著減少建造一個商業(yè)化生產(chǎn)的制造設(shè)施所需的資本支出。與2.1和2.2節(jié)中討論的一致，該法是推動以低成本生產(chǎn)生物仿制藥的驅(qū)動因素之一。有分析表明，即使在500L生物反應(yīng)器的規(guī)模下，連續(xù)生產(chǎn)工藝也能達到17美元/g的低成本。
連續(xù)的層析分離可以采用多種形式進行。周期性的反流層析法是一種形式(來自GE醫(yī)療)，即采用多個層析柱在操作循環(huán)的不同階段實行連續(xù)操作。其他形式包含多柱逆流溶劑梯度凈化，采用ChromaCon公司的ContiChrom®系統(tǒng)、Tarpon Biosystems公司（現(xiàn)為頗爾公司）的BioSMB 技術(shù)從和Semba Bio公司的Octave 層析系統(tǒng)回收的洗脫峰的前部和尾部以增加產(chǎn)量以及純度。
最近在該領(lǐng)域的一場爭論是，為了盡可能提高的生產(chǎn)率，采用端到端的連續(xù)工藝是否需要以及如何實行。為實現(xiàn)該目標(biāo)需要將多個工藝步驟，包括病毒滅活、超濾/透析和病毒過濾工藝整合為一個連續(xù)的流程。隨著時間的推移，不斷地進步的將會出現(xiàn)，但是否需要一個完全連續(xù)的工藝仍有爭議。將連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)與連續(xù)的吸附層析相結(jié)合，然后通過在第3.2節(jié)中描述的高加載精制工藝完成剩余的單抗下游工序，可能已可以滿足需要。
持續(xù)生產(chǎn)工藝的進一步發(fā)展是不可避免的，并將導(dǎo)至供應(yīng)商生產(chǎn)數(shù)量和營銷系統(tǒng)的數(shù)量發(fā)生改變。這一領(lǐng)域已經(jīng)克服了一些關(guān)鍵的技術(shù)障礙，現(xiàn)在的重點是對這些系統(tǒng)進行大規(guī)模的驗證，以及使用快速的過程控制技術(shù)來改進這些系統(tǒng)的控制。在本文列出的新興技術(shù)領(lǐng)域中，因它仍選用傳統(tǒng)的層析填料所，連續(xù)生產(chǎn)似乎是第一個將大規(guī)模實現(xiàn)的系統(tǒng)。
圖8 連續(xù)層析原理
4.2 非層析分離
另一種提高生產(chǎn)率的方法是將層析工藝換為非層析工藝。對層析的依賴的一個關(guān)鍵原因是它能夠處理大量的宿主細(xì)胞蛋白雜質(zhì)，同時將與產(chǎn)品的性質(zhì)高度相似的組分的分離。然而，層析步驟是明顯的限速步驟，尤其是遇到大批量生產(chǎn)的產(chǎn)品時，比如采用大體積的生物反應(yīng)器中進行高表達培養(yǎng)時。生物分離依賴的層析工藝，受限于層析柱的床直徑和床高度。多數(shù)層析填料是可壓縮的，這意味著裝柱時不能使用低壓泵和cGMP生物制藥的系統(tǒng)中使用的系統(tǒng)將柱子超過一定高度。此外，目前最大直徑的層析柱的直徑為2米。因此，即使有了連續(xù)的層析，載量仍然是受限的。非層析分離的設(shè)想是尋找一個代替層析的方法，一次性處理整批細(xì)胞培養(yǎng)收獲液的操作實現(xiàn)生物分離。這有可能極大地提高生物制藥的生產(chǎn)能力。
使用聚合物的選擇性沉淀方案可以在一次操作中捕獲整個生物反應(yīng)器中的產(chǎn)物，而不是依賴于多個層析循環(huán)。如果這些類型的單元操作具有高度選擇性和一般性質(zhì)的，它們將會在大規(guī)模的生物處理中得到廣泛應(yīng)用。有多種聚合物可以用于單抗的沉淀，如陰離子高聚物沉淀產(chǎn)品和辛酸水解宿主蛋白雜質(zhì)。不同機制的聚合物的組合可以創(chuàng)造出更好的選擇性。例如，鹽(高離子強度導(dǎo)至的沉淀)可以與帶電的聚合物結(jié)合，可以通過電荷的中和作用或者通過蛋白質(zhì)分子排斥作用的聚乙二醇(聚乙二醇)實行分離。合適的組合有可能產(chǎn)生高度選擇性的分離，這樣就可以減少下游工序中多個連續(xù)的層析工藝的依賴，也有可能設(shè)計出具有多種機制的聚合物，實現(xiàn)對宿主細(xì)胞蛋白雜質(zhì)或產(chǎn)品的選擇性沉淀。
選擇性沉淀的另一個擴展是絮凝生物反應(yīng)器上清中的細(xì)胞。絮凝劑如低pH (< pH 5.0)和聚合劑,如PDDA(polydiallyldimethylammonium chloride)不僅可以用來沉淀細(xì)胞和細(xì)胞碎片,也沉淀了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)。因此，絮凝劑在在收獲中在已其其他作用的同時，還可用于大規(guī)模去除雜質(zhì)。在某些情況下可以去除大量的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，這樣就可以減少下游工藝步驟。
雙水相萃取(ATPS)通告向溶液中加入混合聚合物和鹽或兩種聚合物而產(chǎn)生兩個分離的水相。如加入PEG-鹽和右旋-PEG APTS。已有數(shù)個采用ATPS實行高選擇性分離的報道。然而，由于分區(qū)機制難以開發(fā)，而且通常不具備足夠的專屬性支持單抗之類的蛋白質(zhì)的分離，所以其大規(guī)模應(yīng)用受到了限制。已有一個PEG/磷酸的ATPS系統(tǒng)實現(xiàn)了從轉(zhuǎn)基因植物提取物中單抗的目的。最近，多步ATPS已經(jīng)開發(fā)出來，試圖為多種不同類型的單抗創(chuàng)建一個統(tǒng)一的平臺?？紤]到分離領(lǐng)域的需求，預(yù)計未來ATPS會有更大的發(fā)展。
所有這些分離技術(shù)都有引入關(guān)注的潛力，并且可以大幅提高現(xiàn)有主流生產(chǎn)設(shè)備的處理能力。然而，所有這些技術(shù)都需要進一步的開發(fā)，以使自己成為可擴展的技術(shù)，可以在不需要優(yōu)化的情況下普遍適用于各種單抗的純化工。
4.3 篩選表達系統(tǒng)
除了哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)外，單抗還可以在其他表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。進一步發(fā)展的一個關(guān)鍵領(lǐng)域是研究替代表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以產(chǎn)生更高的生產(chǎn)力，同時保留與人類免疫系統(tǒng)兼容的糖基化模式。這些發(fā)展可能會使這個領(lǐng)域超越目前最先進的CHO細(xì)胞培養(yǎng)。
一個關(guān)鍵的替代表達系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因植物。其中一些系統(tǒng)已經(jīng)用于臨床生產(chǎn)，例如轉(zhuǎn)基因煙草。使用土壤桿菌（Agrobacterium）瞬轉(zhuǎn)獲得轉(zhuǎn)基因煙草。這種方法被廣泛用于生產(chǎn)中和HIV病毒的抗體。許多公司已經(jīng)開始使用煙草作為首選的表達系統(tǒng)(Medicago, Kentucky Bioprocessing)。然而，轉(zhuǎn)基因植物表達的挑戰(zhàn)仍然包括高水平的內(nèi)毒素和較低的表達水平。另一種擔(dān)憂是蛋白酶的分泌，導(dǎo)至植物提取物的有效期縮短。此外，目前對轉(zhuǎn)基因植物生長的擔(dān)憂限制了這種技術(shù)的擴展性，大規(guī)模生產(chǎn)的實施有賴于公眾的認(rèn)可。將轉(zhuǎn)基因植物與一般的生態(tài)系統(tǒng)分離的要求意味著它們的種植只能局限于大型的、自動化的溫室。這限制了這項技術(shù)的快速擴展。在這一領(lǐng)域進行了大量的研究，植物表達可能是未來大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)的一種技術(shù)。
大腸桿菌的胞內(nèi)和胞外均可產(chǎn)生非糖基化單抗和抗體片段。很有吸引力的是大腸桿菌可以快速培養(yǎng)并達到較高的表達水平。然而大腸桿菌沒有糖基化機制，因此如果糖基化對活性很重要，這可能是限制其應(yīng)用的一個重大的不足。目前，大腸桿菌主要作為單抗生產(chǎn)平臺的補充，僅用于抗體片段的臨床樣品生產(chǎn)。
酵母表達系統(tǒng)已被用于臨床生產(chǎn)。特別的是，啤酒酵母已用來表達商業(yè)多種生物療法的。然而，一個關(guān)鍵的限制是在啤酒酵母中產(chǎn)生過多的非哺乳動物糖基化模式。此外，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤表達和折疊，啤酒酵母的全長度單抗的表達水平受到了限制。畢赤酵母是一種較好的重組蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。這是一種可以在非常高的細(xì)胞密度下培養(yǎng)的甲基營養(yǎng)酵母。在畢赤酵母系統(tǒng)中使用的啟動子非常強大，并且在細(xì)胞外分泌的情況下會產(chǎn)生顯著的表達水平(高達20 g/L)。畢赤酵母的糖基化比在啤酒酵母中要少。畢赤酵母的工程菌株消除了蛋白酶表達的問題，同時也可抑制了高甘露糖的生成。這個系統(tǒng)面臨的另一個挑戰(zhàn)是，在這個表達系統(tǒng)中缺少適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊伴侶。其結(jié)果是，該產(chǎn)品可以以多種形式存在。不過，隨著畢赤酵母的工程菌株被開發(fā)出來，這一障礙可以被克服。畢赤酵母的高產(chǎn)能使其成為單抗未來的候選對象表達體系。
生物制藥生產(chǎn)的另一個新興平臺是微藻生產(chǎn)系統(tǒng)。微藻是一種光合微生物，可在很大數(shù)量的發(fā)酵器中培養(yǎng)。微藻已被用于工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)。當(dāng)前微藻發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)量仍然相對較低。在這個表達系統(tǒng)接受生物制藥生產(chǎn)之前，還需要克服其他障礙，包括糖基化和其他轉(zhuǎn)錄后的修飾。
5結(jié)論
本文討論了單抗平臺方法以及它在加速許多不同療法向臨床和市場的發(fā)展的必要性。使用平臺方法使許多生物制藥公司能夠在一年或更短的時間內(nèi)成功地從基因中取得成功。基于它們的內(nèi)部抗體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)過程，每個生物制藥組織已經(jīng)開發(fā)出了它最適宜的平臺方法。最新的趨勢包括使用多模態(tài)層析法作為工藝平臺的一部分，以及在一種流動模式下使用兩步精制工藝。這些工藝改進使單抗平臺的更廣泛的適用性，以及對下游處理的吞吐量瓶頸有意義。隨著細(xì)胞培養(yǎng)能力的不斷提高，其他可以提高下游工序生產(chǎn)率的替代形式也在不斷發(fā)展。這些包括蛋白質(zhì)在連續(xù)模式下的操作，而不是一種批處理模式?？梢韵胂螅B續(xù)處理可以在未來的整個下游工藝中得到發(fā)展。使用沉淀或ATPS的非層析分離工藝是單抗下游工藝的另一個可能的未來方向。下一個十年將會看到單抗下游工藝平臺的進一步發(fā)展，這是基于生產(chǎn)力和新的分子模型的驅(qū)動。
參考文獻：
Shukla AA, Wolfe LS, Mostafa SS, Norman C.Evolving trends in mAb production processes.Bioeng Transl Med. 2017 Apr 3;2(1):58-69.